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新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是从新加坡养殖石斑鱼中分离的强致病性病原,它可导致石斑鱼高达90%以上的死亡率,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。因此研究该病毒功能基因在病毒组装,复制和侵染中的作用,可以为了解病毒特性,确定疫苗候选基因提供实验依据。
经过人类多年来对病毒结构和病毒致病机理的深入研究发现,囊膜蛋白和带有修饰基团的蛋白,如糖基化和磷酸化的蛋白,一般来说对病毒的生存起到关键性的作用。类胶原结构蛋白(collagen-like protein,CLP)是一类含有胶原重复结构Gly-X-Y三肽的蛋白,目前在水生病毒中只有WSSV和LCDV中有报道,其中WSSV的类胶原结构蛋白已经通过实验证实为具有糖基化修饰的病毒囊膜蛋白。
新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是大分子DNA病毒,为双链环状DNA,其基因组全长140,131bp,共有162个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。通过基因组学和蛋白质组学的研究,我们在SGIV中也发现了两个编码类胶原结构蛋白的基因:ORF055和ORF112。本论文选择SGIV ORF112编码的类胶原结构蛋白CLP112为研究对象。首先,我们对ORF112编码的类胶原结构蛋白进行生物信息学分析,鲒果显示该蛋白有多个预测的糖基化和磷酸化的位点,以及C端一个由20个氨基酸组成的信号肽。其次,我们研究了CLP112的分子特征:RNA转录时序和蛋白质表达时序实验表明该基因编码的是一个病毒的晚期蛋白;在全病毒蛋白和病毒囊膜蛋白的质谱鉴定的基础上,我们又利用免疫胶体金标记技术和Western Blot印记确定了该蛋白为病毒的非囊膜结构蛋白;Western Blot结果表明该蛋白在病毒复制过程中大量表达,其分子量位置也远高于通过蛋白质序列本身算得的分子量,说明天然的CLP112携带有蛋白的修饰基团。紧接着,我们检测了CLP112的亚细胞定位和在病毒复制中的作用。GFP融合蛋白转染和免疫荧光实验的结果一致表明CLP112在宿主细胞中呈胞质分布,且在病毒感染后围绕细胞核和病毒包涵体呈现不均匀的点块状分布;进一步的Morpholino Oligo干扰实验结果揭示ORF112基因的沉默表达可以延迟病毒的复制进度。最后的SGIV感染GS的超薄切片结果也显示出经过Morpholino oligos干扰的GS细胞中,病毒的组装相对正常细胞感染的病毒颗粒来说,结构不完整。说明,CLP112在病毒的组装复制中起到帮助的作用。
根据以上这些结果,我们推测ORF112编码的蛋白质CLP112在SGIV侵染宿主细胞之后的复制组装过程中起到一定的帮助作用,其功能值得进一步深入研究。