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拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国东南沿海地区海水养殖的重要经济蟹类品种，由于其具有繁育时间短、口味独特、富含多种人体所需氨基酸等优点，因此备受政府部门、养殖专家及养殖户的关注。但是随着养殖规模的逐渐扩大，青蟹病害日益严重，2017年5月在三门县某养殖场出现了批量拟穴青蟹死亡现象，为了尽快明确病因减少经济损失，本研究对患病拟穴青蟹的病原菌进行了分离鉴定，并在此基础上筛选对病原菌生长有抑制作用的拮抗菌，以期为拟穴青蟹病害的生物防治提供理论依据。主要研究结果如下：
1.拟穴青蟹致病菌的分离及鉴定
采用TSA和2216E平板培养基，从患病拟穴青蟹血淋巴和肝胰腺中划线分离得到2株细菌QX175061和QX175062。致病性试验和血细胞溶血试验都显示，菌株QX175061和菌株QX175062具有强毒性，对拟穴青蟹LD50分别为4.79×102cfu/g和36.31cfu/g；菌株QX175061在哥伦比亚血平板上呈α溶血，菌株QX175062在哥伦比亚血琼脂平板上呈β溶血。细菌形态观察表明，二菌株都为革兰氏阴性杆菌，具单鞭毛，菌株QX175061菌体大小为(0.6～0.8)μm×(1.0～2)μm，菌株QX175062的菌体大小为(0.8～1.0)μm×(1.0～1.2)μm。生理生化特性测定显示，二菌株都能够产脲酶、氧化酶、接触酶，对0/129敏感，且都能在TCBS上生长，为绿色菌落。16S rRNA及HSP60基因序列分析菌株QX175061与副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）的相似性为100%和99.81%；而16S rRNA序列分析菌株QX175062与美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）的相似性为100%，Ure基因鉴定认为菌株QX175062为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（P.damselae subsp.damselae）。对二株菌感染蟹的组织病理学分析显示，2菌株均能造成青蟹主要组织严重损伤，肝小管萎缩、上皮细胞空泡化、细胞坏死、组织解体；肌组织松散，肌纤维断裂。药物敏感性试验显示，菌株QX175061和菌株QX175062对四环素类、氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类药物相对较敏感，而对β-内酰胺类抗生素相对耐药。
2.青蟹致病菌的拮抗菌分离及筛选
以副溶血弧菌QX175061和美人鱼发光杆菌QX175062为筛选指示菌，采用点种法和纸片法从泥样及拟穴青蟹肠道中筛选获得4株抑菌作用较强的拮抗菌QJ17、QJ22、QJ37、QJ47，它们对副溶血弧菌QX175061的抑菌圈直径分别为12mm、11mm、11mm、22mm；对美人鱼发光杆菌QX175062的抑菌圈直径分别为15mm、12mm、14mm、25mm，其中QJ47抑菌效果最好。通过形态观察、16S rRNA、HSP60、gyrB基因序列分析鉴定菌株QJ17为副溶血弧菌（V.parahemolyticus）、菌株QJ22和QJ37为溶藻弧菌（V.alginolyticus）、菌株QJ47为南极假单胞菌（Pseudomonadaceae antarctica）。安全性检测显示，QJ17、QJ22、QJ37、QJ47等4株菌都没有溶血活性，也不具有细胞毒性，肌肉注射感染青蟹，不会造成青蟹死亡。采用玻璃纸法和硫酸铵沉淀法提取菌株QJ47胞外蛋白，浓度为1.2mg/mL，抑菌实验结果显示，菌株QJ47的胞外蛋白具有抑菌活性，而去蛋白上清液无抑菌活性，说明菌株QJ47的抑菌物质为蛋白质类物质。菌株QJ47的培养条件实验显示，菌株QJ47在温度28°C，盐度15，pH为8时培养，其胞外产物抑菌效果最好。
1.拟穴青蟹致病菌的分离及鉴定
采用TSA和2216E平板培养基，从患病拟穴青蟹血淋巴和肝胰腺中划线分离得到2株细菌QX175061和QX175062。致病性试验和血细胞溶血试验都显示，菌株QX175061和菌株QX175062具有强毒性，对拟穴青蟹LD50分别为4.79×102cfu/g和36.31cfu/g；菌株QX175061在哥伦比亚血平板上呈α溶血，菌株QX175062在哥伦比亚血琼脂平板上呈β溶血。细菌形态观察表明，二菌株都为革兰氏阴性杆菌，具单鞭毛，菌株QX175061菌体大小为(0.6～0.8)μm×(1.0～2)μm，菌株QX175062的菌体大小为(0.8～1.0)μm×(1.0～1.2)μm。生理生化特性测定显示，二菌株都能够产脲酶、氧化酶、接触酶，对0/129敏感，且都能在TCBS上生长，为绿色菌落。16S rRNA及HSP60基因序列分析菌株QX175061与副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）的相似性为100%和99.81%；而16S rRNA序列分析菌株QX175062与美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）的相似性为100%，Ure基因鉴定认为菌株QX175062为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（P.damselae subsp.damselae）。对二株菌感染蟹的组织病理学分析显示，2菌株均能造成青蟹主要组织严重损伤，肝小管萎缩、上皮细胞空泡化、细胞坏死、组织解体；肌组织松散，肌纤维断裂。药物敏感性试验显示，菌株QX175061和菌株QX175062对四环素类、氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类药物相对较敏感，而对β-内酰胺类抗生素相对耐药。
2.青蟹致病菌的拮抗菌分离及筛选
以副溶血弧菌QX175061和美人鱼发光杆菌QX175062为筛选指示菌，采用点种法和纸片法从泥样及拟穴青蟹肠道中筛选获得4株抑菌作用较强的拮抗菌QJ17、QJ22、QJ37、QJ47，它们对副溶血弧菌QX175061的抑菌圈直径分别为12mm、11mm、11mm、22mm；对美人鱼发光杆菌QX175062的抑菌圈直径分别为15mm、12mm、14mm、25mm，其中QJ47抑菌效果最好。通过形态观察、16S rRNA、HSP60、gyrB基因序列分析鉴定菌株QJ17为副溶血弧菌（V.parahemolyticus）、菌株QJ22和QJ37为溶藻弧菌（V.alginolyticus）、菌株QJ47为南极假单胞菌（Pseudomonadaceae antarctica）。安全性检测显示，QJ17、QJ22、QJ37、QJ47等4株菌都没有溶血活性，也不具有细胞毒性，肌肉注射感染青蟹，不会造成青蟹死亡。采用玻璃纸法和硫酸铵沉淀法提取菌株QJ47胞外蛋白，浓度为1.2mg/mL，抑菌实验结果显示，菌株QJ47的胞外蛋白具有抑菌活性，而去蛋白上清液无抑菌活性，说明菌株QJ47的抑菌物质为蛋白质类物质。菌株QJ47的培养条件实验显示，菌株QJ47在温度28°C，盐度15，pH为8时培养，其胞外产物抑菌效果最好。