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亲环素A(CyclophilinA，CypA)是一种广泛表达的细胞蛋白，参与感染、炎症等多种病理反应。CypA在多种病毒的复制过程中都发挥重要的作用。然而，目前在神经坏死病毒复制中CypA发挥的作用知之甚少。NNV最先是从患病的海洋鱼类中分离出来的，目前已在120多种养殖和野生鱼类中都有报道，并给水产养殖业造成了巨大的经济损失。最近还报道发现在实验条件下，一些淡水养殖鱼类也对NNV敏感。因此，对病毒的预防以及治疗需进一步研究。本研究开展了亲环蛋白A在赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染中的功能研究，主要结果如下：
1、斜带石斑鱼(Epinephelus Coioides)亲环蛋白A的克隆和分析。从斜带石斑鱼的鳍条细胞系(GF-1)中克隆得到石斑鱼的CypA基因(GF-CypA)。通过序列分析得到，GF-CypA基因全长为743bp，开放阅读框(ORF)全长495bp，编码164个氨基酸，分子量为17.4kDa。通过生物信息学分析,并使用软件phyre2预测二级结构和三维结构，发现GF-CypA存在β折叠、螺旋以及回文结构，还预测了结合位点、溶剂的连接性以及环路、螺旋和链的百分比。同时，利用多种生物信息学相关软件进行了系统发育分析、多序列比对和同源性分析，推导出CypA的氨基酸序列与其他动物的CypA具有高度保守的PPIase结构域，说明GF-CypA是亲环素A家族的新成员。
2、GF-CypA对RGNNV的增殖的抑制作用。为了研究GF-CypA在RGNNV感染过程中的作用,进行了一系列实验来应对这一挑战。我们观察到GF-CypA在感染RGNNV的GF-1细胞中上调。此外,CypA的过度表达可显著抑制RGNNV在GF-1细胞中的复制,同时也抑制转录和翻译水平。同样，在病毒滴定测定中也观察到RGNNV产生被抑制。相比之下,当GF-CypA在GF-1细胞中被siRNA干扰时,RGNNV的复制得到了增强。在转染GF-CypA后感染RGNNV发现，TNF-2、TNF-α、IL-1b、ISG-15等促炎症因子的显著性表达，暗示着GF-CypA可能参与了宿主促炎症因子的调节。GF-CypA通过增强细胞因子的分泌来抑制RGNNV复制。
3、环孢素A(CsA)对病毒的复制影响。环孢素A(CsA)是一种与CypA结合形成Cs-CypA复合物的免疫抑制剂。它可以抑制钙调蛋白磷酸酶活性，并通过抑制T细胞活化而导致免疫抑制活性。由于CsA与CypA的这种关系，我们还研究了CsA在RGNNV感染GF-1细胞过程中发挥的作用。首先观察不同浓度(0，2，4，8，16 和32μM)不同时间点(12，24，48，72和96)CsA作用后GF-1细胞的增殖情况。结果表明，经4μM处理的GF-1细胞在CsA作用48小时后存活率可达80%以上。因此这一浓度设定为进一步RGNNV复制研究的GF-1细胞的安全浓度。最终发现CsA在早期阶段(0，1，2和3hpi)不影响RGNNV的复制。而在病毒生命周期的后期(6、12、24和48hpi)，CsA可以负调控RGNNV的增殖。最终,当GF-CypA在CsA处理的GF-1细胞中被siRNA干扰并感染RGNNV时,RGNNV的复制在这两个时间点(即感染的早期和后期步骤)都没有得到增强和抑制。结果表明，CsA对RGNNV的抑制与CypA无关。为了考察CsA处理后RGNNV感染过程中CsA对细胞因子表达的影响，分析了ISG-15、IL-1β、TNF-2和TNF-α等几种细胞因子表达。研究结果表明，与pcDNA3.1-CypA转染过表达和空白对照相比，这些细胞因子在CsA处理后的RGNNV感染期间的两个时间点都受到抑制。
本论文的结果为CypA在RGNNV复制过程中发挥的作用提供新的参考，并为防控鱼类RGNNV提供新思路。
1、斜带石斑鱼(Epinephelus Coioides)亲环蛋白A的克隆和分析。从斜带石斑鱼的鳍条细胞系(GF-1)中克隆得到石斑鱼的CypA基因(GF-CypA)。通过序列分析得到，GF-CypA基因全长为743bp，开放阅读框(ORF)全长495bp，编码164个氨基酸，分子量为17.4kDa。通过生物信息学分析,并使用软件phyre2预测二级结构和三维结构，发现GF-CypA存在β折叠、螺旋以及回文结构，还预测了结合位点、溶剂的连接性以及环路、螺旋和链的百分比。同时，利用多种生物信息学相关软件进行了系统发育分析、多序列比对和同源性分析，推导出CypA的氨基酸序列与其他动物的CypA具有高度保守的PPIase结构域，说明GF-CypA是亲环素A家族的新成员。
2、GF-CypA对RGNNV的增殖的抑制作用。为了研究GF-CypA在RGNNV感染过程中的作用,进行了一系列实验来应对这一挑战。我们观察到GF-CypA在感染RGNNV的GF-1细胞中上调。此外,CypA的过度表达可显著抑制RGNNV在GF-1细胞中的复制,同时也抑制转录和翻译水平。同样，在病毒滴定测定中也观察到RGNNV产生被抑制。相比之下,当GF-CypA在GF-1细胞中被siRNA干扰时,RGNNV的复制得到了增强。在转染GF-CypA后感染RGNNV发现，TNF-2、TNF-α、IL-1b、ISG-15等促炎症因子的显著性表达，暗示着GF-CypA可能参与了宿主促炎症因子的调节。GF-CypA通过增强细胞因子的分泌来抑制RGNNV复制。
3、环孢素A(CsA)对病毒的复制影响。环孢素A(CsA)是一种与CypA结合形成Cs-CypA复合物的免疫抑制剂。它可以抑制钙调蛋白磷酸酶活性，并通过抑制T细胞活化而导致免疫抑制活性。由于CsA与CypA的这种关系，我们还研究了CsA在RGNNV感染GF-1细胞过程中发挥的作用。首先观察不同浓度(0，2，4，8，16 和32μM)不同时间点(12，24，48，72和96)CsA作用后GF-1细胞的增殖情况。结果表明，经4μM处理的GF-1细胞在CsA作用48小时后存活率可达80%以上。因此这一浓度设定为进一步RGNNV复制研究的GF-1细胞的安全浓度。最终发现CsA在早期阶段(0，1，2和3hpi)不影响RGNNV的复制。而在病毒生命周期的后期(6、12、24和48hpi)，CsA可以负调控RGNNV的增殖。最终,当GF-CypA在CsA处理的GF-1细胞中被siRNA干扰并感染RGNNV时,RGNNV的复制在这两个时间点(即感染的早期和后期步骤)都没有得到增强和抑制。结果表明，CsA对RGNNV的抑制与CypA无关。为了考察CsA处理后RGNNV感染过程中CsA对细胞因子表达的影响，分析了ISG-15、IL-1β、TNF-2和TNF-α等几种细胞因子表达。研究结果表明，与pcDNA3.1-CypA转染过表达和空白对照相比，这些细胞因子在CsA处理后的RGNNV感染期间的两个时间点都受到抑制。
本论文的结果为CypA在RGNNV复制过程中发挥的作用提供新的参考，并为防控鱼类RGNNV提供新思路。