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无机焦磷酸酶参与多种代谢途径中产生的焦磷酸的水解作用。该酶通过在DNA和RNA聚合反应、辅酶的合成等过程中扮演的重要作用来维持机体的正常代谢进行。在体外,焦磷酸酶可应用于体外转录合成高产量的RNA、去除DNA聚合反应中累积的焦磷酸盐、去除基于焦磷酸检测的SNP基因分析过程中所用的试剂中污染的焦磷酸等。由于该酶应用广泛,所以本课题通过将该酶异源表达和纯化,来研究其性质以及稀有密码子对其表达的影响,为下一步的应用奠定基础。
本论文的研究内容包括四方面:(1)酿酒酵母无机焦磷酸酶基因克隆载体和表达载体的构建,(2)酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达和纯化,(3)酿酒酵母无机焦磷酸酶相关酶学性质研究,(4)稀有密码子对酿酒酵母无机焦磷酸酶表达的影响。
研究表明:(1)通过设计引物,PCR扩增目的基因,连接克隆载体和表达载体用琼脂糖凝胶电泳很直观的看到目的基因的大小为850bp左右,与目的基因实际标准长度864bp相符合。(2)通过在大肠杆菌中进行表达,然后利用蛋白纯化系统分离纯化目的蛋白,测定了其中一组分离纯化后的目的蛋白浓度、活性和比活,结果分别为0.312g/L,31.13units/mL,99.73uints/mg。(3)研究酿酒酵母无机焦磷酸酶的酶学性质,选取初始反应时间,温度、pH,三个因素,通过测定不同时间,温度、pH条件下酶的活性,确定其最适初始反应时间为1min,最适温度为45℃,最适pH为7.5。(4)稀有密码子对大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶表达的影响效果明显,通过在目的基因起始密码子ATG后插入2或4个编码精氨酸的稀有密码子,结果发现终止了酿酒酵母无机焦磷酸酶的表达。虽然稀有密码子具有明显降低外源蛋白翻译速率能力,但是其功能与起始密码子的距离,还有本身数量有都很大关系,如果距起始密码子太近或稀有密码子数量太多,直接导致翻译提前终止,导致目的蛋白不表达,因此要考虑其他方法来降低蛋白表达速率。