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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是显花植物在长期进化过程中,雌蕊的柱头或者花柱可以辨别自体和异体花粉,阻止自体受粉而利于异花授粉,从而保持高度杂合性促进远缘繁殖时产生的一种重要生殖机制。SI现象在显花植物中非常普遍,生产中利用不同单倍型的自交不亲和系进行杂种配制,是芸薹属植物杂交育种的重要方式。甘蓝(Brassica oeracea L.)作为世界上重要的十字花科蔬菜作物,也是我国秋冬季重要的叶菜类蔬菜作物。自交不亲和性是甘蓝杂种生产的重要途径,具有杂种优势较强、选育易、周期短等优点。目前,甘蓝自交不亲和系的选育和繁殖主要采用蕾期人工剥蕾授粉,该方法操作麻烦、效率低、费工费时、制种成本高,大大降低了甘蓝杂种生产的经济效益。因此,如何实现自交不亲和系的简便繁殖成为甘蓝育种家们一直期望解决的问题。包括化学、物理、生物学及机械等方法被用于克服自交不亲和以实现花期自交授粉。如花期喷洒一定浓度的Nacl溶液和硼酸,电刺激,高温处理,混合花粉授粉,CO2处理,Y射线辐射,钢刷授粉等。这些方法虽然能够在一定程度上提高甘蓝自交结实率,但是这些方法操作复杂易使柱头受伤,田间操作难度大。随着自交不亲和性遗传机制及其分子机理越来越明晰,利用现代分子生物学手段,有望从根本上解决自交不亲和的调控问题。为进一步研究自交不亲和关键因子对自交不亲和性的影响,开发甘蓝自交不亲和性人工调控生物技术手段,本研究通过农杆菌介导转化法将柱头特异启动子SLR驱动下的反义MLPK基因和在柱头特异启动子SLG13驱动下的SLGi基因导入自交不亲和甘蓝材料‘TF’,通过反义干扰MLPK基因和RNA干扰SLG基因的表达,研究MLPK和SLG在自交不亲和信号传导过程中的作用及功能,为解析MLPK和SLG基因参与芸薹属SI信号传导的机制提供直接或间接的试验证据。另外,将Cre/loxp重组系统和AlcR/alcA乙醇诱导基因表达系统相结合,构建了一套基于乙醇诱导表达的甘蓝自交不亲和性人工调控系统,实现甘蓝自交不亲和系的简便繁殖和F。制种应用。本研究中获得主要结果如下：1、构建了以Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCABarMLPK,通过农杆菌介导法将其导入自交不亲和甘蓝‘TF’中。花期柱头MLPK基因的表达显示,转基因甘蓝植株花期柱头内源MLPK mRNA积累量明显低于野生型对照植株。花粉原位萌发的荧光显微观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交后,吸附在柱头上的花粉粒大量萌发,且穿过柱头的花粉管明显增加,并导致花期自交结籽数量上升,转基因植株花期和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。试验结果表明,下调MLPK基因表达能部分打破甘蓝自交不亲和,提高其花期自交结籽能力。2、通过农杆菌介导转化法将pCABarSLGi载体导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。花粉原位萌发荧光显微观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交授粉后大量花粉粒被吸附于柱头表面并萌发,可见明显的花粉管束穿过柱头,导致花期自交结籽数量增加,其花期自交亲和指数在1.03-13.96之间,显著高于花期自交亲和指数为0.06的野生型对照植株。荧光定量PCR分析显示,转基因甘蓝植株花期柱头中的SLG基因mRNA积累量显著低于非转基因野生型植株。结果表明,干扰内源SLG基因的表达,对打破甘蓝自交不亲和性有积极作用,可导致花期自交结籽能力大幅度上升。3、将组合有Cre/loxp重组系统和AlcR/alcA乙醇诱导基因表达系统以及SLGi干扰结构的植物表达载体pCABaralcRSLGi,通过农杆菌介导转化法导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。花粉原位萌发荧光显微观察结果显示,转基因植株花期自交可见大量花粉粒被吸附于柱头表面并大量萌发形成花粉管束穿过柱头。转基因植株花期自交后亲和指数在0.66-14.7之间,均显著高于野生型对照植株。荧光定量PCR分析结果显示,转基因甘蓝植株在花期柱头中的SLG基因]mRNA积累量显著低于非转基因野生型植株mRNA积累量,并可在柱头中检测到alcR基因的表达。对pCABaralcRSLGi-5 T,代转基因植株用1%-5%浓度的乙醇进行灌根处理,显示5%浓度的乙醇诱导能够高效删除SLG-RNAi基因干扰表达盒。进一步对5个不同的pCABaralcRSLGi转基因单株后代群体利用5%的乙醇处理三次,结果显示,仅17号单株T1代植株获得高达60%的删除效率,其余单株后代在同样处理条件下删除效率较低,删除不完全导致嵌合体产生。基于pCABaralcRSLGi-5的后代单株乙醇诱导后Bar基因、alcR基因以及Cre基因表达随诱导时间的变化结果显示,随着乙醇诱导时间的增加,Bar基因mRNA积累量逐渐增加,而alcR基因因不断删除,其mRNA积累量逐渐下降,与此同时,Cre基因的mRNA在乙醇施加初期大量积累,随着时间延长,Cre基因mRNA积累量逐渐降低。