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在热带亚热带地区,龙眼(Dimocarpus longan L.)是一个重要的木本果树。本研究在RNA-Seq的基础上,首先通过序列分析和比对,找到龙眼中107个与调控开花时间相关的基因,发现D1ELF4-1和D1ELF4-2可能与‘四季蜜’龙眼特殊成花性状相关；进一步克隆获得D1ELF4-1和D1ELF4-2全长cDNA,通过生物信息学和荧光定量PCR分析对其功能进行初步分析；同时克隆了‘四季蜜’和‘红核子’龙眼D1ELF4-1基因的启动子序列,并对其进行生物信息学分析；还构建了D1ELF4-1和D1ELF4-2植物表达载体,为进一步研究D1ELF4-1和D1ELF4-2功能做准备。研究结果有助于了解龙眼开花调控的分子机制。主要研究结果如下：1.在以‘四季蜜’龙眼和‘立冬本’龙眼的嫁接新梢为材料的RNA-seq数据库中,找到了107个开花时间同源基因。这些基因进一步的被归类为生物钟和光周期途径,春化途径,自主途径,GA途径,年龄相关基因和成花途径整合基因等6类。采用log2(S_RPKM/L_RPKM)方法比较了这107个基因在‘四季蜜’和‘立冬本’两个样品中的表达差异,发现ELF4 (Unigene4309和Unigene5963)在两样本中表达差异较大,其中ELF4(Unigene4309)在‘四季蜜’中表达量显著的上调。荧光定量PCR进一步验证了ELF4(Unigene4309)在‘四季蜜’中表达量的变化,表明在调控‘四季蜜’龙眼特殊成花性状上,ELF4(Unigene4309)可能起着重要的作用。2.在RNA-seq数据库中,找到了两个ELF4基因的拼接序(Unigene4309和Unigene5963),其中Unigene4309包含完整的编码区,命名为D1ELF4-1;Unigene5963包含ELF4基因的部分编码区,命名为D1ELF4-2。本试验中以‘红核子’龙眼叶芽为材料,克隆了两个龙眼ELF4同源基因cDNA序列。D1ELF4-1 cDNA全长为544 bp,编码140个氨基酸,等电点为5.05,为酸性不稳定蛋白；D1ELF4-2 cDNA全长为733 bp,编码144个氨基酸,等电点为5.17,为酸性不稳定蛋白。序列分析结果表明D1ELF4-1和D1ELF4-2蛋白具有ELF4蛋白的保守作用域DUF1313。聚类分析结果表明D1ELF4-1和AtELF4聚在一起,D1ELF4-2和AtELF4-LIKE 1聚在一起。3.实时荧光定量PCR研究两个D1ELF4基因在‘红核子’龙眼花芽分化过程的表达。结果表明,D1ELF4-1基因在11月份表达量急剧下降,表明D1ELF4-1功能与抑制花芽分化有关；D1ELF4-2基因在1月份开始下调表达,表明它可能抑制花芽形态的分化。D1ELF4-1和D1ELF4-2基因在调控龙眼开花时间上功能可能有所不同。4.为了探究引起D1ELF4-1表达差异的原因及进一步了解D1ELF4-1的功能,本试验中以‘四季蜜’龙眼和‘红核子’龙眼的叶片为材料,克隆D1ELF4-1的启动子序列,最终获得‘四季蜜’龙眼D1ELF4-1起始密码ATG上游序列1330bp,获得‘红核子’龙眼D1ELF4-1起始密码ATG上游序列419bp。序列比对后发现在‘四季蜜’和‘红核子’龙眼中D1ELF4-1基因起始密码ATG上游-1bp—-249bp之间序列一样,而‘四季蜜’中的-250bp—-1330bp和‘红核子’中的-250bp—-419bp序列存在差异。启动子序列分析结果表明D1ELF4-1的表达受光、激素及逆境胁迫调控。与‘红核子’相比,在‘四季蜜’中有多个光响应元件、激素响应元件、逆境胁迫响应元件及其他调控元件,这些差异是否是引起D1ELF4-1在‘四季蜜’和‘立冬本’嫁接新梢中差异表达的原因,需要进一步克隆‘红核子’D1ELF4-1基因的启动子序列并进行分析。5.为了进一步研究D1ELF4-1基因和D1ELF4-2基因的功能,在本试验中,将D1ELF4-1连接到pBI121质粒上,获得重组质粒pBI121-D1ELF4-1；将D1ELF4-2连接到pCAMBIA2300-35S-OCS质粒上,获得重组质粒pCAMBIA2300-DlELF4-2.