【摘 要】
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热带爪蛙(Xenopus tropicalis)是经典的模式动物之一，在热带爪蛙中建立基因编辑技术对于深入了解特定基因的功能、建立人类疾病模型具有重要作用。到目前为止，采用ZFN、TALENs
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热带爪蛙(Xenopus tropicalis)是经典的模式动物之一，在热带爪蛙中建立基因编辑技术对于深入了解特定基因的功能、建立人类疾病模型具有重要作用。到目前为止，采用ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9在热带爪蛙中进行基因敲除已经实现，但应用于热带爪蛙发育机制的研究较少，而定点基因插入还尚未见诸报道。研究主要分为以下两个部分: 首先，我们以TALENs和CRISPR/Cas9敲除平台为基础，针对热带爪蛙调控胰腺和神经系统发育的重要转录因子ptf1a/p48进行敲除，研究Ptf1a/p48功能缺失对热带爪蛙发育后期肢体发育的影响。结果显示:ptf1a/p48敲除的G0代嵌合体胚胎在发育后期出现明显的前肢缩短畸形;ptf1a/p48纯合敲除个体死于前肢发生之前。深入的调控机制研究有待在模式动物小鼠中展开。 其次，我们以此平台为基础，进一步借鉴细胞和斑马鱼系统中发展的非同源末端连接介导的定点基因插入技术，在热带爪蛙中建立了高效、可遗传的定点基因插入系统。通过实验的探索和优化，我们在热带爪蛙ets1第五外显子成功实现了基因定点插入，插入接头处显示为不精确的非同源末端连接修复的特征;我们进一步采用内含子打靶策略，成功实现了对tyr和tubb2b编码框的精确编辑;种系传递分析和Southern杂交检测均证实了在ets1和tyr位点预期的定点插入。
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