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背景与目的 von Hippel-Lindau(VHL)病是一种罕见而危害严重的常染色体显性遗传病，表现为家族性多发性多器官性良恶性肿瘤症候群，发病率约1∶36000。VHL病临床表现复杂多样，目前已发现位于14个脏器的40种不同病变，以中枢神经系统(CNS)血管母细胞瘤(HB)、视网膜HB、嗜铬细胞瘤、肾细胞癌、肾囊肿、胰腺内分泌肿瘤、胰腺囊肿及内淋巴囊肿瘤等为特点。患者多在18～30岁（平均29岁）出现临床症状，并终身不断发生各种VHL相关病变。VHL病致死率、致残率均较高，患者预期寿命中位数仅49岁，加上其为常染色体显性遗传病，对个人、家庭及社会均造成严重危害。目前国内VHL病多为个案报道，由于对VHL病的认识不足，大多数病例漏诊。本研究中，我们搜集了21例VHL病（除4例外均漏诊），并与63例散发性HB作比较，对其临床病理特点、治疗、随访及预后进行观察研究。 VHL病预后差，延长VHL病患者生存时间，提高其生活质量的关键是早期诊断、早期治疗、终身随访、优生优育。目前国内外VHL病的确诊均依靠临床诊断标准，无法满足上述要求。分子病理检测，即VHL基因胚系突变检测，不但可为VHL病可疑患者提供早期诊断，还可以为患者后代进行产前、产后或胚胎植入前诊断。VHL病根据是否伴发嗜铬细胞瘤和肾细胞癌分为几个亚型，各型患者胚系突变特点有所不同，因此分子病理检测还有助于患者分型，进一步判断预后。目前国内外虽尚未建立统一的分子病理检测方法和诊断标准，但全球范围内对VHL基因胚系突变特点已有一些研究，而关于中国人VHL基因遗传学改变的研究较少，不足10例，且缺乏与临床表型关系的研究及与国外VHL病遗传学特点的对比。在本研究中，我们收集了10例中国VHL家系，对其遗传学改变及其与临床表型的关系进行研究并与国外VHL病遗传学特点进行对比。还对其中1例VHL家系中2个儿童进行了遗传学筛查。 VHL病是一种常染色体显性遗传的肿瘤综合征，由VHL基因胚系突变所致。VHL基因属肿瘤抑制基因，一对等位基因的失活是发生相关肿瘤的主要机制。VHL相关性肿瘤中，一条等位基因的失活由VHL基因胚系突变所致，发生于生殖细胞，遗传性或非遗传性，失活机制通常为较小的基因内部突变，可在患者的正常体细胞中检测到;而另一条等位基因的失活则由VHL基因体系突变所致，仅存在于VHL相关性病变的肿瘤组织中，已知VHL基因体系突变机制包括杂合性缺失(loss ofheterozygosity，LOH)导致的基因重组、点突变以及启动子区域CpG岛的甲基化。VHL相关性HB是VHL病中最常见的病变，在VHL患者中的发生率在90％以上，虽然已有部分关于VHL相关性HB中VHL基因失活机制的研究报道，但结果不尽相同，尚无定论。此外近年来有研究表明位于6q24-25的ZAC1基因于散发性HB的发生有关，可能与VHL相关性HB的发生亦有一定关系。本研究中，我们收集了发生于14例VHL患者的24个VHL相关性CNS-HB，对VHL基因及ZAC1基因在VHL相关性HB中的表达情况及可能的失活机制进行了探讨。 研究方法 从南京军区南京总医院1990年1月至2009年6月的手术标本中收集84例CNS-HB。仔细查阅患者的性别、年龄、症状、体征、B超、CT、核磁共振(MRI)、眼底镜检查、手术记录等，了解患者是否存在多发性CNS-HB或其它VHL相关病变。采用信件和电话的方式对患者进行随访，详细了解家族史、是否存在新发病变、治疗及预后等情况。根据VHL病的临床诊断标准在84例CNS-HB中搜集到21例VHL病（除4例外临床均漏诊），余63例为散发性CNS-HB。VHL病的临床诊断标准[6]为:(1)两个以上HB（CNS和/或视网膜）;(2)一个HB加上一种VHL病的相关表现;(3) CNS或视网膜HB的家族史加上一个HB或一种VHL病的相关表现。符合其中一项者即可诊断。观察比较VHL相关性HB和散发性HB的临床病理特征，分析HB的免疫组化表型。收集10例VHL家系中14例患者的外周血标本，用SSCP及DNA测序的方法进行VHL基因胚系突变检测，并结合既往文献报道，分析17例中国人VHL基因胚系突变特点。收集14例VHL患者的24个CNS-HB，用LOH和免疫组化的方法研究VHL基因和ZAC1基因的LOH及表达，探索VHL相关性HB的发生机制。 研究结果 一、VHL病诊断的复杂性: 根据VHL病临床诊断标准，本研究从84例CNS-HB患者中收集到21例VHL病患者（国内最大组），其中17例漏诊，漏诊率高达81.0％，多数仅诊断HB。 (1)20例(95.2％)以CNS-HB为首发表现就诊，1例以右岩骨内淋巴囊瘤为首发表现就诊。 (2)10例(47.6％)患者存在单个或多个其它VHL相关病变:①视网膜血管瘤6例，男、女各3例，年龄12～34岁，平均20.5岁，以视力下降就诊，单侧4例，双侧2例。②胰腺肿瘤4例，男1例，女3例，年龄23～26岁，平均25.5岁，以腹胀或呃逆就诊。MRI示胰腺囊实性肿块，实性部分直径3.8～12cm，平均6.1cm，2例合并胰腺囊肿。患者中2例因肿瘤巨大无法手术，1例全切除，1例放弃手术。③肾脏肿瘤1例，女，20岁，因腹胀就诊，CT示左肾囊实性肿块，3.8cm×3.6cm×3.6cm，行左肾切除。④肾囊肿4例，男、女各2例，年龄25～50岁，平均31.8岁，均为B超检查时意外发现，单侧及双侧各2例，囊肿大小1.2～4cm。⑤右侧岩骨肿瘤1例，女，33岁，因右耳鸣、听力下降及面神经瘫痪就诊，MRI示右岩骨肿块，浸润性生长，大小4cm×3cm×2cm，行肿瘤全切除。 (3)10例(47.6％)首诊为单发CNS-HB，其中8例在随访期间出现多发性CNS-HB和/或其它VHL相关肿瘤。 (4)21例VHL病患者中13例有VHL病家族史，8例(38.1％)无家族史。 二、VHL相关性HB患者及散发性HB患者临床特点的差异: (1)首次就诊年龄:①21例VHL病患者:男11例，女10例，首诊年龄9～58岁，平均29.5岁。②63例散发性HB患者:男34例，女29例，年龄15～77岁，平均43.0岁。VHL相关性HB较首次就诊年龄显著低于散发性HB(P＜0.001)。 (2) HB发生部位、性质及大小:①21例VHL病患者:先后共发生87个CNS-HB，位于小脑、脑干、脊髓者分别为55个(63.2％)、15个、17个，其中实性者55个，囊实性者32个。HB实性成分直径0.5cm～3.8cm，平均1.6cm。②63例散发性HB:位于小脑、脑干、脊髓者分别为51例(81.0％)、6例、6例，其中实性者28例，囊实性者35例。实性成分直径0.3cm～5.2cm，平均2.1cm。VHL相关性HB较散发性HB更易发生于脑干和脊髓(P=0.019)并以实性肿瘤多见(P=0.010)。 (3)预后:①21例VHL病患者:随访18例，随访时间1个月～21年，平均8年9个月，生存14例，死亡4例，复发2例，再发11例。生存者中，无瘤生存5例，带瘤生存9例，其中残障4例（失明2例，偏瘫1例，失明+偏瘫1例）。死亡者中，25岁及28岁的2例患者，因胰腺肿瘤巨大无法手术切除死亡，另2例因CNS-HB术后并发症死亡。2例复发者均为CNS-HB部分切除者，分别于术后1年4个月和2年10个月复发。1例23岁VHL病女性患者，当地医院影像诊断胰腺囊肿，作者建议其来本院行CT增强扫描，发现胰腺囊性病灶中存在实性肿瘤，并行胰腺肿瘤切除术，目前无瘤生存。②63例散发性HB患者:随访42例，随访1个月～13年，平均5年7个月，生存39例(92.9％)，死亡3例，复发3例。生存者中，无瘤生存37例，带瘤生存2例，其中残障3例（偏瘫和/或偏身感觉障碍）。死亡者中，1例复发后放弃治疗死亡，2例死于术中及术后并发症。复发者中，全切除1例，部分切除2例，复发时间为术后1年～6年8个月（平均3年9个月）。VHL相关性HB较散发性HB术后无瘤生存率低(P＜0.001)。 三、VHL病患者终生存在新发肿瘤的可能: 21例VHL病患者，11例在随访期间再发各种VHL相关病变，1年、5年、10年再发率分别为16.7％、50.0％、61.1％。随访两年以上的15例患者共发生82个VHL相关肿瘤，1～12个/人（平均5.5个/人），每人每1.4年新发1个。其中1例患者13年间发生12个CNS-HB，1例患者4年间发生5种VHL相关肿瘤，1例患者9年间手术次数多达6次。 四、CNS-HB的组织学特点及其与预后的关系: (1)异型核瘤细胞:本组91例CNS-HB中，21个(75.0％) VHL相关性HB和44个(69.9％)散发性HB见异型核瘤细胞，局部较密集。肿瘤中均无核分裂，无坏死。异型核瘤细胞较密集的6例HB中Ki-67均＜1％，随访2例，生存11年9个月和4年9个月。 (2)侵犯脑组织:本组91例CNS-HB中，1例VHL相关性和10例散发性 HB可见肿瘤侵犯周围脑组织;10例散发性HB可见成片的脑组织裹入肿瘤中;9例VHL相关性和12例散发性HB可同时观察到肿瘤侵犯脑组织和脑组织裹入肿瘤中。总计本组肿瘤侵犯脑组织:VHL相关组10例，散发组22例，共32例(38.1％)。随访有脑组织侵犯的8例VHL相关性HB及13例散发性HB患者均生存，前者生存10个月～13年10个月（平均6年7个月），后者生存1年4个月～10年9个月（平均5年7个月）。 (3)细胞增殖指数:①VHL相关性HB:间质细胞Ki-671％和2％的分别为11例和4例，随访4例Ki-672％者生存3年5个月～21年2个月（平均10年2个月）。②散发性HB:间质细胞Ki-671％、2％、5％的分别为10例、3例、2例，随访2例Ki-672％者生存5年4个月～6年5个月（平均5年11个月），2例Ki-675％者生存1年6个月～2年4个月（平均1年11个月）。 (4)免疫组织化学标记VHL相关性HB和散发性HB各15例，间质细胞阳性表达:Vimentin100％、EGFR90.0％、Inhibinα86.7％、D2-4056.7％; CD34及CD68均阴性;3例间质细胞表达GFAP。电镜下肿瘤细胞胞质内富含脂滴。标记结果及电镜观察结果与预后无关。 五、VHL相关性肿瘤的组织学特征: (1)透明细胞性肾细胞癌1例，核分级Ⅱ级，免疫组化CD10阳性。(2)胰腺内分泌肿瘤1例，免疫组化Syn和CgA阳性。(3)胰腺微囊性腺瘤1例，镜下肿瘤呈大小不一的腺管状，内衬低柱状上皮，细胞轻度异型，无核分裂，免疫组化CK8/18阳性，Syn和CgA阴性，Ki-67＜2％。(4)内淋巴囊肿瘤1例，浸润性生长，破坏骨质，肿瘤呈乳头和腺管状，被覆立方细胞，腺管扩张，内含PAS阳性的胶样分泌物，免疫组化CKpan阳性，EMA和TTF1阴性，Ki-67＜5％。 六、VHL基因胚系突变检测结果: (1)10个VHL家系中7个检测出VHL基因内部的胚系突变，共6个不同突变。它们分别为3个错义突变（Ser65Trp，Val130Phe，Arg167Gln），1个无义突变（Arg177Stop）和2个剪切位点突变(553+1G→A，553+5 G→C)。所有突变均位于55～200号密码子之间。 (2)本组发现Val130Phe（家系Ⅳ）突变为国内外首次报道。 (3)应用SSCP和DNA测序的方法对1个VHL家系中2个年龄分别为6个月和3岁的儿童进行了产后分子病理学筛查，结果均未携带致病基因，目前仍在随访中。 (4)我们对国内仅报道的14例VHL家系的胚系突变特点进行回顾性分析，（本研究7例加文献7例），其中5例(35.7％) VHL基因胚系突变位于157～189号密码子之间，4例(28.6％)位于110～131号密码子之间，3例(21.4％)位于75～98号密码子之间，仅2例位于这些热点区域外。 七、VHL相关性HB中VHL基因体系突变及表达: (1) SSCP检测及DNA测序，24个VHL相关性HB均未发现VHL基因体系点突变。 (2) VHL相关性HB于VHL基因附近(3p25-26)的LOH检测:24个VHL相关性HB中14个(58.3％)检测到LOH。在104/105、D3S1038、D3S1317、D3S1335位点上缺失的比例分别为41.7％(5/12)、37.5％(9/24)、11.8％(2/17)、6.7％(1/15)。104/105和D3S1038位点上的缺失率明显高于D3S1317和D3S1335位点。 (3)免疫组化示VHL蛋白主要表达于正常小脑颗粒层细胞的胞浆中。VHL相关性HB中VHL蛋白可表达于血管内皮细胞，间质细胞VHL蛋白阴性或局灶弱阳性表达。 八、VHL相关性HB中ZAC1基因的突变及表达: (1) VHL相关性HB于ZAC1基因附近(6q23-25)的LOH检测:24个VHL相关性HB中11个(45.8％)检测到LOH。在D6S310、D6S409、D6S314位点上缺失的比例分别为30％(6/20)、26.3％(5/19)、13.3％(2/15)。6例VHL相关性HB(25％)同时在3p25-26和6q23-25检测到杂合性缺失。4例在这两个区域均未检测出杂合性缺失。 (2)免疫组化示ZAC1蛋白在主要表达于正常小脑组织的浦肯野细胞胞质及其突起内，而VHL相关性HB中ZAC1蛋白无表达。 结论 一、国内对VHL病认识不足，大多数病例漏诊 (1)熟悉VHL病的临床诊断标准（①两个以上HB（中枢神经系统和/或视网膜）;②一个HB加上一种VHL病的相关表现;③中枢神经系统或视网膜HB的家族史加上一个HB或一种VHL病的相关表现。符合其中一项者即可诊断）、了解VHL病相关病变（视网膜HB，胰腺内分泌肿瘤、胰腺微囊性腺瘤，透明细胞性肾细胞癌，肾囊肿及岩骨内淋巴囊肿瘤等）是提高确诊率的前提。建议对可疑患者行眼底镜、腹部B超、腹部CT、脑和脊髓MRI、尿儿茶酚胺等全面筛查以确诊。对患有胰腺内分泌肿瘤/胰腺囊肿、肾细胞癌/肾囊肿的年轻患者要尤为重视，必要时对HB患者行遗传学检查。 (2) VHL病多以CNS-HB为首发表现就诊，熟悉VHL相关性和散发性HB的临床差异，是提高VHL病确诊率的关键。VHL病患者首诊年龄较散发性HB患者年龄小10岁左右。VHL相关性HB实性者为多，散发性HB囊实性者为多。CNS-HB均好发于小脑，但VHL相关性HB较散发性HB更易发生于脑干和脊髓。因此强调对无家族史的单发性HB患者，如年龄小、肿瘤位于脑干或脊髓、且为实性病灶时应高度警惕。 (3) VHL病虽为遗传性疾病，但仅60％的患者有家族史，其余为非遗传的新发病例。因而无家族史的患者不可轻易排除VHL病。 二、VHL病预后明显差于散发性HB (1) VHL病无瘤生存率明显低于散发性HB。 (2) CNS-HB引起的偏瘫和视网膜HB导致的失明或视力显著下降，是VHL综合征的主要致残原因。 (3) VHL病患者终生都存在新发VHL相关肿瘤的可能，平均每人每1～2年新发1个VHL相关肿瘤。因此每1～2年应对VHL病确诊患者进行一次全面检查，以便早期发现、早期治疗，改善预后。 (4) VHL病中胰腺内分泌肿瘤多合并胰腺囊肿，影像学检查通常更容易发现胰腺囊肿而可能忽略胰腺实性肿瘤。因此VHL患者以胰腺囊肿就诊时需警惕胰腺实性肿瘤的存在。 三、CNS-HB的组织学特征及其与预后的关系 (1) HB均为良性肿瘤，但多数HB可见异型核瘤细胞，局部较密集，作者认为此改变同细胞增殖指数无关。 (2)本研究提出HB肿瘤中较多的异型核细胞、稍高的细胞增殖指数和侵犯脑组织均与预后无关。 (3) EGFR、Inhibinα和D2-40是标记HB间质细胞较稳定而敏感的抗体，可用于HB的诊断及鉴别诊断（转移性透明细胞性肾细胞癌、毛细胞星形细胞瘤、神经内分泌癌等）。 四、VHL基因胚系突变特点 (1)本研究首次报道国内VHL患者携带的VHL基因胚系突变的分布特点同国外基本相似，85.7％位于既往报道的热点区域内，仅2例位于这些热点突变区域外。该发现为VHL病的分子病理诊断提供了一定的基础 (2)1例携带Arg167Gln突变的VHL患者（58岁），仅表现为多发性CNS-HB，无嗜铬细胞瘤和肾细胞癌，而国外文献报道携带该突变VHL患者易合并嗜铬细胞瘤和肾细胞癌。国内VHL家系中该突变与表型的关系尚待进一步研究。 五、VHL基因的LOH可能是VHL相关性HB的主要发生机制 (1)本研究发现VHL相关性HB中基因内部突变不是VHL等位基因失活的主要机制。 (2) VHL相关性HB在3p24-25区域的LOH比例超过50％，提示该区域的杂合性缺失导致的基因重组可能是VHL相关性HB中VHL等位基因失活的重要机制。 (3) VHL蛋白在VHL相关性HB的间质细胞中无表达。 六、ZAC1基因可能参与VHL相关性HB的发生 (1) VHL相关性HB在ZAC1基因附近的LOH比例约50％，提示ZAC1基因同样在VHL相关性HB的发生中起到一定作用。 (2) ZAC1蛋白在VHL相关性HB的间质细胞中无表达，同散发性HB相似。