大肠杆菌L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达与应用

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通过设计一对长引物以及PCR的方法,从大肠杆菌K-12中扩增出了L-阿拉伯糖异构酶基因araA。以pMD18-T作为构建克隆载体的过渡,经过测序鉴定以及BLAST比对正确后,再将其克隆到表达载体pET-28a上,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,成功的构建出了能够表达L-阿拉伯糖异构酶的工程菌。   对重组菌株进行15℃低温诱导表达后,通过SDS-PAGE分析发现,该重组菌能够表达出大量的目的蛋白,且主要为可溶性的胞内表达,仅极少量的包涵体表达。足量的目的蛋白以及重悬菌液的高酶活,使得可以直接利用重组菌的菌悬液进行活力测定以及D-塔格糖的转化反应。   以重悬菌液为酶源、D-半乳糖为底物,研究了温度、pH、二价金属离子以及Mn2+浓度对酶活的影响。其结果表明:酶的最适温度为60℃;最适pH为7.6;酶活测定中加入Mn2+能显著提高酶活;1mM Mn2+足以使得EDTA处理后的L-阿拉伯糖异构酶恢复活力,而且还能提高相对原始酶液约60%的活力。   以重悬菌液为粗酶,D-半乳糖为底物,研究了底物浓度、温度、pH、二价金属离子以及Mn2+浓度对D-塔格糖转化反应的影响。其结果表明:D-塔格糖转化反应的最佳反应温度为60℃;最佳体系pH为7~9,此时D-塔格糖的产率均能达到35%~40%;最佳底物浓度为100g/LD-半乳糖;转化时加入Mn2+有助于提高D-塔格糖产量;经EDTA处理后的酶液,明显不具备转化能力,但加入Mn2+后,能使酶液恢复初始酶液转化D-塔格糖的能力,但并不随着Mn2+浓度的提高而增大。   以对照组和含葡萄糖组为测定对象,研究了D-葡萄糖存在时,温度、pH、二价金属离子这些因素对L阿拉伯糖异构酶酶活的影响,以及上述最适反应条件下,D-葡萄糖的存在对D-塔格糖转化反应的影响。其结果表明D-葡萄糖对L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质并无影响,而且对转化D-塔格糖的产量并无很大影响。
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