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链霉菌是土壤微生物,能分泌大量的次级代谢产物,如抗生素、杀真菌剂或除草剂、大量的蛋白和水解酶,被广泛用于工业和农业.同时链霉菌特别是变铅青链霉菌(Streptomyce lividans)经1 0余年的研究也已发展成为新的高效分泌异源蛋白的表达体系,能够分泌表达大量具有生物学活性的表达产物.由于链霉菌高效分泌机制的重要性,有必要进一步研究其分泌相关机制.原核生物的Sec途径(general secretory pathway,Sec;GSP)是主要的蛋白质分泌系统,此途径同样存在于链霉菌中,包括SecA、SecE、SecG、SecY、SecD、SecF和SecDF等多种蛋白参与.本工作根据相关文献报道和已发表的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorA3(2))基因组中sec基因上游设计引物扩增S.lividans TK24的secA、secY、secDF、secD和secF基因上游片段和secE基因上游三个不同长度的片段.将扩增片段克隆至T载体进行测序.将扩增片段克隆至以儿茶酚加氧酶基因(xylE)为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,获得的重组质粒转化S.lividans TK24原生质体,重组菌株命名为S.lividans[pIJ4083-secX].重组菌株在CM培养基中发酵,收集不同时间的发酵菌丝,检测报告基因的表达,研究了sec启动子的表达特性.比较了不同secE启动子片段,确定secEl,secE2,secE3均具有启动子活性,secEl活性最高,secE3最低.原核细胞中的蛋白酶体特别是链霉菌中的蛋白酶体是近年发现的一种蛋白水解系统,为了研究它在链霉菌异源基因表达中的作用,本实验室的洪斌博士构建了链霉菌异源蛋白表达宿主菌S.lividans TK24的蛋白酶体缺失菌株S.lividans PRO41,为本工作奠定了基础.本工作构建了带有蛋白酶体基因的质粒pPROAPR,并转入S.lividans PRO41得到蛋白酶体缺失恢复菌株S.lividans PRO41Ⅳ,通过荧光检测酶活验证了蛋白酶体活性的缺失和恢复.研究了蛋白酶体缺失对两种异源蛋白—人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(soluble human tumor necrosis factor receptor Ⅱ,hsTNFRⅡ)和鲑鱼降钙素(salmon calcitonin,sCT)分泌表达的影响.