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拓扑异构酶Ⅰ(TopⅠ)是一种在生物体内参与细胞内DNA复制、转录、修复和重组等关键过程的酶类之一，其主要通过DNA链剪切与再连接循环机制解决DNA扭转张力问题。自1988年证实真核生物TopⅠ是喜树碱及其衍生物的唯一作用靶标以来，大量研究也揭示喜树碱及其衍生物主要通过稳定结合于DNA复制与转录过程中暂时形成的TopⅠ-DNA可裂解复合物(TopⅠcc)来实现对细胞生长的抑制作用。本研究在开展前发现0.1-30μM喜树碱处理后的甜菜夜蛾中肠脂肪体细胞(IOZCAS-Spex-Ⅱ)生长停止，并伴随细胞凋亡特征出现，同时还发现可能由TopⅠcc引发的DNA链断裂现象。鉴于喜树碱对昆虫和癌细胞的毒理特征类似，本文探讨了喜树碱发展成为植物源农药先导化合物的可能性，首先测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞粗酶液中甜菜夜蛾TopⅠ酶解螺旋活性的影响，然后进行甜菜夜蛾TopⅠ基因克隆与TopⅠ蛋白质原核表达纯化，继而测定了喜树碱和羟基喜树碱对纯化TopⅠ酶解螺旋活性的影响，并通过荧光定量PCR测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞内TopⅠ基因表达水平的影响，最后测定了喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内甜菜夜蛾TopⅠ酶活性的动态变化，旨在从基因水平、转录水平和酶活性水平上阐明喜树碱对甜菜夜蛾TopⅠ靶标的作用方式和机制，从而揭示喜树碱对昆虫生长抑制和致死作用的分子毒理机制，主要结论如下：
通过联合反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(RACE)分别扩增甜菜夜蛾TopⅠ基因核心序列(1626 bp)及其两末端序列。TopⅠcDNA全长序列为3743bp，其中5UTR(非编码区)和3UTR(非编码区)分别80bp和870bp，编码区中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)长度为2793bp，编码930个氨基酸，以UAA为终止密码子。Clustalx软件多重比对结果表明，甜菜夜蛾TopⅠ氨基酸序列与11个物种同源性均超过42.58%，并与家蚕TopⅠ氨基酸序列同源性达到65.25%。以MEGA5.0构建的进化树显示，甜菜夜蛾TopⅠ与喜树TopⅠ间遗传进化距离较远，从而揭示出氨基酸多态性的存在与喜树碱敏感性或抗性发生相关。相比喜树TopⅠ，甜菜夜蛾TopⅠ蛋白质中喜树碱结合位点如E418，Q421，L617，R621，A653，E710，N722，S729(根据人TopⅠ氨基酸序列编号)没有发生突变，从分子进化水平上表明甜菜夜蛾TopⅠ是天然的喜树碱敏感蛋白质。
为证实甜菜夜蛾TopⅠ是否具有喜树碱敏感特性，本研究建立TopⅠ酶反应外体系，通过超螺旋DNA解旋法测定喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞粗酶液TopⅠ和纯酶TOP70酶解螺旋活性的抑制影响。TOP70是去除N端335个氨基酸的非完整性TopⅠ蛋白质，通过构建PGEX-TOP70重组载体，并在大肠杆菌BL21(DE)菌株中诱导表达纯化而得。抑制结果表明，喜树碱及羟基喜树碱对TopⅠ酶解螺旋活性和纯酶TOP70的抑制影响具有浓度依赖性，呈类“S”型动力学曲线变化。当药物浓度在1.00-7.50μM间，喜树碱抑制率显著高于羟基喜树碱抑制率，而在浓度分别为0.01-1.00μM和7.50-100μM时，两药物抑制率无显著差异性。喜树碱及羟基喜树碱对TOP70的抑制率高于药物对细胞粗酶液TopⅠ的抑制率，这表明蛋白纯化可消除未知蛋白对药物抑制率的影响，但不同状态下的酶本质上是不变的，只有量上的差异。
细胞内甜菜夜蛾TopⅠ蛋白质对喜树碱具有敏感性，同时这种敏感性具有瞬时性和累积性，而不具有浓度依赖性。本研究采用酶液2倍稀释法测定每个药物处理下细胞内TopⅠ酶活性，并作比较分析。结果表明，不同时间点上(0，2，4，6，12，24，48 h)对照组细胞内TopⅠ酶比活力值间无显著差异(相对比活力值为1)。10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞表现出较为一致的时间积累性，随着处理时间的积累，TopⅠ酶活性逐渐降低到一个水平。两药物在24h对细胞内TopⅠ酶活性抑制率无显著差异，但在48h喜树碱对细胞内TopⅠ酶活性的抑制率显著高于羟基喜树碱，可检测到该时间点的细胞内TopⅠ不能解旋DNA。同时，喜树碱和羟基喜树碱对细胞内TopⅠ酶活性的影响没有显著的浓度相关性。除了0.50μM羟基喜树碱没有抑制细胞内TopⅠ酶活性外，其余浓度梯度下的喜树碱和羟基喜树碱都能显著降低细胞内TopⅠ酶活性(0.10，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100μM)，浓度间TopⅠ酶比活力值无显著差异性。
细胞内甜菜夜蛾TopⅠmRNA表达量对喜树碱敏感性降低，而这种敏感性具有时间累积性，不呈浓度依赖性。通过荧光定量PCR测定每个药物处理组和对照组中TopⅠmRNA表达量，并用2-△△Ct方法进行浓度间和不同时间点间的比较分析。结果表明，在不同时间点上(0，2，4，6，12，24，48 h)对照组细胞内TopⅠmRNA表达量间无显著差异(相对基因表达为1)。在12，24和48h，检测到10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱处理后的IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内TopⅠmRNA表达量都上调增加。但在48h，喜树碱处理细胞内TopⅠmRNA表达量仍然高于羟基喜树碱处理细胞内TopⅠmRNA表达量。除了50.0和100μM羟基喜树碱外，其余各浓度下喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内TopⅠmRNA表达量都能上调增加(0.10，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100μM)，浓度间TopⅠmRNA表达量无显著差异性。
综上所述，喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内TopⅠ的作用是多水平交叉的，从而实现对细胞生长的抑制并诱导细胞死亡。基于TopⅠ基因序列与细胞药物反应的分析，证实喜树碱对甜菜夜蛾TopⅠ的多水平影响建立在转录水平上而不是在复制水平上。
通过联合反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(RACE)分别扩增甜菜夜蛾TopⅠ基因核心序列(1626 bp)及其两末端序列。TopⅠcDNA全长序列为3743bp，其中5UTR(非编码区)和3UTR(非编码区)分别80bp和870bp，编码区中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)长度为2793bp，编码930个氨基酸，以UAA为终止密码子。Clustalx软件多重比对结果表明，甜菜夜蛾TopⅠ氨基酸序列与11个物种同源性均超过42.58%，并与家蚕TopⅠ氨基酸序列同源性达到65.25%。以MEGA5.0构建的进化树显示，甜菜夜蛾TopⅠ与喜树TopⅠ间遗传进化距离较远，从而揭示出氨基酸多态性的存在与喜树碱敏感性或抗性发生相关。相比喜树TopⅠ，甜菜夜蛾TopⅠ蛋白质中喜树碱结合位点如E418，Q421，L617，R621，A653，E710，N722，S729(根据人TopⅠ氨基酸序列编号)没有发生突变，从分子进化水平上表明甜菜夜蛾TopⅠ是天然的喜树碱敏感蛋白质。
为证实甜菜夜蛾TopⅠ是否具有喜树碱敏感特性，本研究建立TopⅠ酶反应外体系，通过超螺旋DNA解旋法测定喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞粗酶液TopⅠ和纯酶TOP70酶解螺旋活性的抑制影响。TOP70是去除N端335个氨基酸的非完整性TopⅠ蛋白质，通过构建PGEX-TOP70重组载体，并在大肠杆菌BL21(DE)菌株中诱导表达纯化而得。抑制结果表明，喜树碱及羟基喜树碱对TopⅠ酶解螺旋活性和纯酶TOP70的抑制影响具有浓度依赖性，呈类“S”型动力学曲线变化。当药物浓度在1.00-7.50μM间，喜树碱抑制率显著高于羟基喜树碱抑制率，而在浓度分别为0.01-1.00μM和7.50-100μM时，两药物抑制率无显著差异性。喜树碱及羟基喜树碱对TOP70的抑制率高于药物对细胞粗酶液TopⅠ的抑制率，这表明蛋白纯化可消除未知蛋白对药物抑制率的影响，但不同状态下的酶本质上是不变的，只有量上的差异。
细胞内甜菜夜蛾TopⅠ蛋白质对喜树碱具有敏感性，同时这种敏感性具有瞬时性和累积性，而不具有浓度依赖性。本研究采用酶液2倍稀释法测定每个药物处理下细胞内TopⅠ酶活性，并作比较分析。结果表明，不同时间点上(0，2，4，6，12，24，48 h)对照组细胞内TopⅠ酶比活力值间无显著差异(相对比活力值为1)。10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞表现出较为一致的时间积累性，随着处理时间的积累，TopⅠ酶活性逐渐降低到一个水平。两药物在24h对细胞内TopⅠ酶活性抑制率无显著差异，但在48h喜树碱对细胞内TopⅠ酶活性的抑制率显著高于羟基喜树碱，可检测到该时间点的细胞内TopⅠ不能解旋DNA。同时，喜树碱和羟基喜树碱对细胞内TopⅠ酶活性的影响没有显著的浓度相关性。除了0.50μM羟基喜树碱没有抑制细胞内TopⅠ酶活性外，其余浓度梯度下的喜树碱和羟基喜树碱都能显著降低细胞内TopⅠ酶活性(0.10，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100μM)，浓度间TopⅠ酶比活力值无显著差异性。
细胞内甜菜夜蛾TopⅠmRNA表达量对喜树碱敏感性降低，而这种敏感性具有时间累积性，不呈浓度依赖性。通过荧光定量PCR测定每个药物处理组和对照组中TopⅠmRNA表达量，并用2-△△Ct方法进行浓度间和不同时间点间的比较分析。结果表明，在不同时间点上(0，2，4，6，12，24，48 h)对照组细胞内TopⅠmRNA表达量间无显著差异(相对基因表达为1)。在12，24和48h，检测到10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱处理后的IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内TopⅠmRNA表达量都上调增加。但在48h，喜树碱处理细胞内TopⅠmRNA表达量仍然高于羟基喜树碱处理细胞内TopⅠmRNA表达量。除了50.0和100μM羟基喜树碱外，其余各浓度下喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内TopⅠmRNA表达量都能上调增加(0.10，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100μM)，浓度间TopⅠmRNA表达量无显著差异性。
综上所述，喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内TopⅠ的作用是多水平交叉的，从而实现对细胞生长的抑制并诱导细胞死亡。基于TopⅠ基因序列与细胞药物反应的分析，证实喜树碱对甜菜夜蛾TopⅠ的多水平影响建立在转录水平上而不是在复制水平上。