印度芥菜BjCET1基因的启动子克隆及其功能分析

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随着工农业等人类活动的日益加剧,土壤和水体重金属污染成为严重影响动植物生长发育以及人类生命健康的重要因素。印度芥菜(Brassica juncea L)是一种重金属超富集植物,对多种重金属离子(如Zn、Cd、Co、Ni、Pb、Cs等)具有超富集能力,是植物修复技术的主要模式植物之一,可用于重金属污染土壤的植物修复过程。本研究从印度芥菜中利用Genome Walking技术克隆了其CE家族蛋白基因BjCET1的启动子,命名为BjCET1P。通过测序获得其碱基序列并利用生物信息学方法对其功能进行了预测。同时,本研究利用农杆菌侵染法获得了拟南芥和烟草的BjCET1P转基因植株。通过重金属胁迫处理和GUS组织染色,对BjCEH1P转基因植株进行了初步分析。取得的实验结果如下:  1.采用Genome Walking术克隆了BjCET1P启动子。根据PLACE启动子分析软件分析得知,印度芥菜BjCET1基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-215nt处,该序列除包含启动子中心元件外,还包含多种功能元件如光应答元件(CACGTG)、厌氧应答元件(TGGTTT)、分生组织表达应答元件(GCCACT)、脱落酸应答元件(ACGTGGC,CACGTG)、抗旱应答元件(TAACTG、CGGTCA)、低温应答元件(CCGAAA)、防御和胁迫应答元件(ATTTTCTTCA)、转录增强元件(TTTCTTCTC)和光应答元件(ATTAAT)等。  2.利用分子生物学技术成功构建了pBI121-BjCET1-1P-GUS,pBI121-BjCET1-2P-GUS、pBI121-BjCET1-3P-GUS真核表达载体,并进行了拟南芥和烟草转化,获得了转基因阳性植株。  3.对野生型拟南芥和烟草及其pBI121-BjCET1P-GUS转基因拟南芥和烟草进行非生物胁迫处理,并通过GUS组织染色分析BjCET1P在植株体内的表达情况,发现该启动子在拟南芥的根、茎、叶中都有表达,而在烟草中主要在根上部表达,且BjCET1P具有强启动本底和重金属诱导增强表达的特性。  4.本研究依据BjCRP1已知启动子序列经同源克隆获得印度芥菜一Cd响应启动子,命名为BjCRP1P2。经测序得知该启动子全长1073bp,根据PLACE启动子分析软件分析,该启动子除包含启动子中心元件外,还包含多种功能元件如脱落酸响应元件(ACGTG)、与干旱诱导有关的MYB结合位点(WAACCA)、光诱导响应元件(GCCAC)、调节类黄酮(一类植保素)生物合成元件(CNGTTR)、细胞分裂素调节基因ARR1结合位点(NGATT)、木质部基因簇识别顺式作用元件(ACAAAGAA)等。
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