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在番茄和油梨中,HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的表达和活性是早期果实发育所必须的,因为它催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲羟戊酸的不可逆反应,这一步是植物类异戊二烯代谢途径中的限速步骤。类异戊二烯化合物在一系列的生理反应中扮演十分重要的角色,包括生物膜组成成分固醇的合成,生长调节剂(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)的形成、电子转运以及植物抗毒素的生成。另外有研究表明高水平的HMGR表达活性多发生在植物分生组织和处于分裂生长状态下的悬浮细胞中。因此认为HMGR参与到果实的发育,并为果实的细胞分裂和生长提供充足的类异戊二烯化合物。
本论文主要目标是克隆荔枝龙眼中的HMGR基因,并研究该基因在果实发育过程中的表达特点,同时初步探讨不同生长调节物质对HMGR基因的调控效应。本论文得到的主要研究结果如下:
(1)摸索出一种更有效、更实用的程序化设计简并引物(CodeHop引物)的方法,它所设计的引物扩增效率高,特异性强,具有很好的应用前景。
(2)结合实验要求和特点,提出了一套实用性很强的扩增5末端cDNA序列的方法,其扩增原理、引物设计和PCR策略都具有很强的创新性。
(3)从荔枝中克隆到1个新的HMGR基因——Lc-hmg2,并成功扩增得到它的全长序列。cDNA序列全长2209bp,编码569个氨基酸,其中5端非编码区和3端非编码区分别长154bp和348bp。
(4) 从龙眼中克隆得到2个HGMR基因:Dl-hmg1和Dl-hrag2。Dl-hmg1 cDNA序列全长2235bp,编码564个氨基酸;其中5端非编码区长56bp,3端非编码区长484bp:Dl-hmg2 cDNA序列全长2199bp,一共编码568个氨基酸;其中5端非编码区长133bp,3端非编码区则长359bp。
(5)对Lc-hmg1的5末端cDNA序列进行重新克隆,证实了原有序列的错误,经过拼接得到了更为准确的Lc-hmg1 cDNA全长序列。
(6)利用生物软件和生物数据库对荔枝龙眼中的4个HMGR基因进行了生物信息学分析,对HMGR基因的理化性质、序列组成特征、信号肽、亲,疏水性、跨膜结构以及高级结构都有了较为详细的了解。
(7)对不同器官中Lc-hmg2的表达研究表明,Lc-hmg2在荔枝的果实的果皮和假种皮、根、茎和幼叶中都有较高的表达水平,其中以幼果的表达水平最高;而在种子和老叶中的表达量很少。这充分说明Lc-hmg2主要在植物幼嫩器官即分裂比较旺盛的器官中表达水平也比较高。
(8)果实发育期间,‘鹅蛋荔’中Lc-hmg2的平均表达强度要高于‘淮枝’,且前者表达高峰出现在花后35d-63d之间,后者出现在花后14d-28d之间,可见前者表达高峰期出现得比较晚,持续时间远长于后者。这将有助于解释‘鹅蛋荔’果实平均重量大于‘淮枝’果实这一现象。
(9)不同生长调节剂对‘淮枝’荔枝果实中Lc-hmg2的调控结果表明,NAA(100mg/L)和TDZ(10mg/L)处理后,二者在一定程度都能促进果皮中Lc-hmg2的表达。当在花后52d施用25mg/L的Mevinol in(HMGR的竞争性抑制剂)时,果皮和假种皮中Lc-hmg2的表达都受到一定的抑制。
(10)‘灵龙’龙眼早晚花果果实生长型基本一致,呈单“S”曲线。早花果果实在快速生长期各部分的平均增长速率都大于晚花果,从而导致快速生长末期早花果中各部分的重量明显高于晚花果的。
(11)Northem分析表明,在‘灵龙’龙眼中Dl-hmg1随着果实的发育其表达呈现逐渐下降的趋势,另外其在早花果中的表达强于晚花果;在果实的发育过程中,Dl-hmg2的表达基本稳定,类似于组成性表达,只在晚花果种子中其表达则有一定的起伏。这可以说明在龙眼中Dl-hmg1在果实生长调控方面作用更大,而Dl-hmg2的组成性表达很可能只是为了满足果实发育过程中对类异二烯化合物的基本需求。此外,NAA处理对Dl-hmgl和Dl-hmg2两基因的表达都有一定的促进作用。