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目的:体外检测LDR、IM7对CML白血病干/祖细胞凋亡的影响,并探讨其相关作用机制。
方法:取20例健康产妇脐血100ml,免疫磁株法分离纯化CD34+、CD38-的正常造血干细胞(HSCs);取20例初诊慢性髓细胞白血病(CML)慢性期患者骨髓液5～10ml,免疫磁株法分离纯化富集CD34+、CD38-、CD123+的自血病干/祖细胞。处理一:将上述分离出的两组细胞给予不同的剂量(0、12.5和50cGy)照射,辐照后于24、48和72h收集细胞,流式细胞仪检测不同剂量对两种干/祖细胞的细胞周期分椎及凋亡率的影响;RT-PCR和荧光实时定量PCR检测两种干/祖细胞中P16基因的变化。处理二:将分离出的白血病干/祖细胞与IM7(20μg/ml)孵育后,应用Annexin-V试剂盒检测IM7诱导LSCs凋亡状况;荧光实时定量PCR及RT-PCR检测LSCs中原癌基因C-myc、NF-kB表达状况;Western-blot检测LSC中Bcl-2蛋白表达变化。
结果:
(1)CML-LSCs经12.5cGy剂量照射后P16 mRNA表达略上调,50cGy剂量照射后P16 mRNA水平明显增高(P=0.002),而HSCs经各剂量点LDR处理后P16基因转录水平无明显的变化。
(2)LSCs经12.5cGy剂量处理后48h及50cGy剂量点照射后72h均出现了G0/G1期阻滞现象。
(3)LSCs经LDR处理后,细胞的早期凋亡率随时间推移逐渐增加,50cGy照射后72h处凋亡率(％)为17.75±11.76,与未照射组(8.13±4.71)相比,差异有统计学意义。
(4)经IM7孵育后LSCs的早期凋亡率(％)由对照组5.42±1.84升高至12.58±2.84。
(5)荧光实时定量PCR及RT-PCR检测结果均提示IM7孵育后LSCs中原癌基因C-myc、NF-kB mRNA水平表达明显降低,同时NF-KB激活-核转运检测结果表明IM7孵育后LSCs中NF-kB的活性受到抑制。
(6)IM7(20μg/ml)能显著抑制CML-LSCs中Bcl-2蛋白表达。
结论:
1.LDR及IM7在体外均能诱导CML白血病干/祖细胞的凋亡。
2.LDR可能通过P16基因转录水平的表达上调,使得CML-LSCs阻滞在G0/G1期,促进LSCs的凋亡。
3.抗CD44单克隆抗体IM7与白血病干/祖细胞上的受体CD44分子结合后抑制NF-kB的活性,引起下游靶基因C-myc及Bcl-2的表达下调从而诱导LSCs凋亡。
4.本研究为LDR及抗CD44单克隆抗体在白血病中的应用提供理论依据。