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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制剂是一种广泛应用的微生物杀虫剂，但溶源性噬菌体(lysogenic phage)的爆发常常给Bt的工业生产带来巨大的损失。深入研究溶源性噬菌体的特性及其功能基因将为解决这一重大课题提供重要的理论和技术基础。本文以Bt噬菌体MZTP02的orf3和orf4为研究对象，对其进行了生物信息学分析，克隆并表达了这两个基因，研究了它们在自然状况下在溶源菌株中的转录与表达，利用基因敲除技术将两个基因缺失并研究了基因缺失后对出发菌株特性及噬菌体形成的影响。
orf3基因位于基因组nt600～ nt1514之间，全长915 bp，编码304个氨基酸，预计编码蛋白的分子量大小为34.89 kDa；orf4基因位子基因组nt1504～nt2778之间，全长1275 bp，编码424个氨基酸，预测编码蛋白的分子量大小为49.37 kDa。在orf3上游存在一个典型的启动子元件：TTCCA(—35 box)和CTCTATTAT(-10 box)；orf4与orf3的11 bp重叠，此重叠区域的ATGAAA恰好为一个启动子的—35 box，这也暗示了两个基因的转录紧密连锁关系。序列分析表明，它们分别与噬菌体末端酶大小亚基有较高的同源性，分别达79％和70％。保守域分析表明，它们分别属于terminase—2和terminase—6亚家族。蛋白质的二级结构预测分析显示：Orf4中存在与已研究大亚基一致的模序，推测Q—模序可能是位于第16、17位的氨基酸：KQ；Walker A模序可能是位于第40-48位的氨基酸：GSIRAGKT；Walker B模序可能是位于第138-143位的氨基酸：GMFFDE；C—模序可能是位于第162-164位的氨基酸序列： EGS，也可能是位于第203-205位的氨基酸序列：SLS，但是前者可能性较大；ATP结合位点([AG]—x(4)—G—K—[ST])可能有两处，一处位于第40-55位的氨基酸序列：GSIRAGKTVSMALSYV，另一处位于第68-81位的氨基酸序列：GMAGKTIGSLRRNV，其中前者可能性比较大，此项预测与前面的Walker A模序预测有很好的一致性，进一步说明了40-55位的氨基酸序列为ATP结合位点的可能性。
克隆了orf3和orf4两个基因，基因序列与GenBank中的序列一致。并将orf3克隆到表达载体pQE30上，orf4克隆到pET32a(+)上，实现了两个基因的原核表达，两个蛋白均为融合蛋白，Orf3目的蛋白在N—端融合有6×His标签，Orf4目的蛋白在C—端同样融合有6×His标签。对目的蛋白进行了可溶性分析，可以形成可溶性和包涵体两种形式的蛋白。融合蛋白经6×His蛋白纯化试剂盒非变性纯化后，用超滤管进行脱盐浓缩，及肠激酶酶切释放目标蛋白。对两个蛋白产物进行活性测定，实验结果表明：Orf3具有DNA结合活性，Orf4具有ATPase活性。
对orf3和orf4两个基因进行RT—PCR分析，结果显示两个基因在正常培养条件下的溶源菌株中均有转录，并且在同一个转录本上。Northern blot和步移RT—PCR法确定了转录本的大小，存在两个转录本，分别为7.0 kb和5.3 kb。为了检测正常培养条件下溶源菌株中两个基因的表达状况，将在E.coli中表达的两个蛋白加以纯化，免疫新西兰大白兔，制备了Orf.和Orf4的蛋白抗体，Western blot结果显示这两个基因在宿主菌中均有表达。
构建了orf3和orf4基因的敲除载体pRNTAB，并利用同源重组技术获得了orf3和orf4基因的缺失株T6。利用不同浓度的丝裂霉素(Mitomycin，MMC)和双氧水(H2O2)对突变菌株进行诱导，未能检测到噬菌体的形成。