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在哺乳动物的胚胎干细胞中，Nanog是维持细胞全能性和抑制细胞分化的一个关键因子。然而关于其在早期胚胎发育过程中的功能研究却受限于哺乳动物胚胎的发育方式而未能得到深入研究，斑马鱼胚胎即是一个很好的研究早期胚胎发育的模型。为了研究斑马鱼nanog基因在早期胚胎发育过程中的功能，我们克隆鉴定了斑马鱼的nanog基因，通过一系列表达敲降、基因敲除、过表达、遗传互作、蛋白互作等实验，发现斑马鱼Nanog在早期胚胎发育过程中抑制Wnt/β-catenin信号通路并揭示了这一过程的分子机制。具体结果如下: 一、斑马鱼nanog存在强烈的母源表达，早期合子表达呈现均一性，且表达的mRNA至胚盾时期(shield)之后快速消失。利用morpholino(MO)技术对斑马鱼nanog基因进行表达敲降，发现高剂量敲降导致胚胎的严重背部化，低剂量敲降则导致胚胎的后部化。前者类似于母源性Wnt/β-catenin信号过激活的表型，而后者类似于合子型的Wnt/β-catenin信号过激活的表型。 二、对nanog敲降胚胎中Wnt/β-catenin信号通路靶基因的表达进行分析，发现nanog敲降显著激活Wnt/β-catenin信号通路的转录活性;更重要的是，低剂量nanog MO注射所导致的胚胎后部化表型可以被wnt8a的敲降所拯救。在体外培养的细胞中，过表达nanog能够显著抑制全长β-catenin或持续入核的ΔN-β-catenin过表达所诱导激活的Wnt/β-catenin信号活性，提示Nanog直接在核内参与抑制Wnt/β-catenin信号通路活性。 三、为了更加清晰地刻化nanog的体内功能，我们利用TALEN技术成功构建斑马鱼nanog基因的突变体。有意思的是，nanog的合子突变体(Zygoticmutant of nanog, Znanog)并未表现出明显的发育缺陷，并且成鱼能够正常交配并产下后代，因此我们方便地获得了nanog的母源合子突变体——MZnanog(maternal-zygotic mutant of nanog)。在MZnanog胚胎中，Wnt/β-catenin信号活性显著升高且胚胎呈现严重背部化，这显示母源Nanog功能的缺失导致了母源Wnt/β-catenin信号的过度激活。 四、为了验证Nanog是否通过经典的调控β-catenin入核水平的方式来调控Wnt/β-catenin信号活性，我们利用western blot和免疫荧光的方法检测了MZnanog胚胎细胞核中的β-catenin水平。结果发现，nanog的缺失虽然导致Wnt/β-catenin信号活性的上升，但并没有导致核内β-catenin的水平上升。这表明，Nanog并不是通过影响β-catenin的入核而抑制其信号转导。 五、进一步通过免疫共沉淀实验，发现Nanog能够通过其N端的结构域与激活型的TCF蛋白TCF7潜在的Groucho结合区(Groucho binding domain，GroBD)实现蛋白-蛋白水平的互作，而这一互作干扰了β-catenin与TCF7形成转录激活复合体的能力，从而抑制Wnt/β-catenint信号活性。因此，Nanog缺失的细胞核内游离的β-catenin则有更多的机会与原本被Nanog占据的TCF相结合，从而形成β-catenin/TCF转录激活复合体，这从分子水平上解释了Nanog功能缺失所导致的Wnt/β-catenin信号过度激活及相应的表型。 六、最后，我们利用MZnanog胚胎为对象，通过过表达一系列抑制Wnt/β-catenin转录活性或干扰TCF与β-catenin互作的分子，均可以显著降低MZnanog胚胎中的β-catenin信号活性，进而有效拯救MZnanog的背部化发育缺陷。这些实验从体内水平上验证了这一全新的Wnt/β-catenin转录调控机制。 七、此外，在构建nanog突变体的过程中，我们发现了一种广泛存在于斑马鱼胚胎发育过程中的DNA双链断裂修复方式——微同源介导的DNA末端连接修复（microhomology-mediated end joining，MMEJ）。不同于以往的研究，我们发现MMEJ是一种独立的修复方式，其在非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)和同源重组(Homologous recombination，HR)正常工作时也能高效地被用于修复DNA双链断裂;更重要的是，斑马鱼胚胎中的MMEJ修复依赖于DNA连接酶Ⅲ(Lig3)，而不依赖于DNA连接酶Ⅳ（Lig4）。这表明斑马鱼可以作为一个开展DNA修复机制的优良体内研究模型，结合TALEN、CRISPR/Cas9等基因敲除技术和MMEJ的修复特点，使得我们将能高效实现可预期突变序列的基因敲除和精细基因组操作。