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植物在生长过程中,基因组不断复制但不进行有丝分裂而导致细胞倍性水平升高的过程称为核内复制。核内复制通过细胞、代谢和遗传效应在生理及发育过程中起重要作用。干旱被认为是导致全球作物产量大幅减少的不利条件之一,因此鉴定出调节抗旱性相关的新型遗传因子可能是提高作物生产力的先决条件。与其他常见作物相比(如小麦和玉米等),棉花被认为是一种适应干旱胁迫先驱作物,这在一定程度上为我们提供了一个极好的模式植物,来描述植物中调节耐旱性的潜在新基因。在本研究中,我们从亚洲棉中发现了编码DNA拓扑异构酶ⅥB亚基的GaTOP6B基因,其参与调控细胞的核内复制过程,同时还影响植物对干旱的响应。本实验中使用了病毒诱导基因沉默(ⅥGS)技术降低亚洲棉中GaTOP6B的表达,还通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动GaTOP6B在拟南芥中超表达,分析GaTOP6B对细胞核内复制和植物耐旱性的潜在影响。结果如下:1、从亚洲棉分离出AtTOP6B同源基因并命名为GaTOP6B。GaTOP6B的ORF长2010 bp,编码669个氨基酸。其蛋白序列含有GHKL、H2TH和Transducer三个高度保守的结构域,除棉属外,与可可、长果黄麻在进化上亲缘关系最近。2、在亚洲棉的根茎叶中均有GaTOP6B基因的表达,叶中的表达量最高。洋葱表皮的亚细胞定位显示GaTOP6B定位于细胞核上。3、将亚洲棉中GaTOP6B基因通过ⅥGS技术降低表达量后,植株表现出矮小的症状。流式细胞术检测显示其核内复制水平降低并伴随着核体积的减小。此外,断水20天后,GaTOP6B沉默的亚洲棉叶片表现出更加萎蔫的状态,其脯氨酸、叶绿素含量及抗氧化酶活性降低,丙二醛含量增加,气孔开度较大并伴随着较低的叶片相对含水量和较高的失水率。胁迫相关基因P5CS,RD22,DREB1A,NCED3的表达水平降低。4、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥与野生型相比有着较高的生长活性。流式细胞术检测显示其核内复制水平较高并伴随着核体积的增大。断水14天后,转基因拟南芥萎蔫症状不明显,其脯氨酸含量较野生型拟南芥高。气孔先于野生型拟南芥闭合并伴随着较高的叶片相对含水量和较低的失水率。胁迫相关基因RD29,NCED3,COR15A,DREB1A的表达水平升高。5、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥叶片的转录组数据显示,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥中的基因有着较高的转录活性。在200 mM的甘露醇处理后,转基因拟南芥中的差异基因主要与代谢相关,其编码蛋白质并在胁迫耐受中起作用,包括植物防御素、细胞壁生物合成、海藻糖生物合成和谷胱甘肽代谢等,通过诱导生理、生化如增强的防御、细胞壁增厚、渗透调节和清除ROS来提高转基因拟南芥的耐旱性。