大黄鱼鱼卵和鱼精过敏原的性质研究

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大黄鱼,作为我国重要的经济鱼类,其产量逐年增加。随着福建大黄鱼特色加工区域的形成和对提高大黄鱼加工副产物附加值的重视,大黄鱼鱼卵和鱼精的开发利用越来越引起研究者的关注。但是存在于鱼卵和鱼精中的过敏原若在加工过程中未被去除,则容易引起过敏人群出现过敏反应,带来食品安全问题。这在一定程度上制约了大黄鱼加工产业的发展。因此,开展大黄鱼鱼卵和鱼精过敏原的研究尤为重要。本实验利用20份大黄鱼鱼卵过敏患者血清,通过ELISA和Western-blotting分析确定了大黄鱼鱼卵中的主要过敏原为16kDa的蛋白组分。采用丙酮沉淀、硫酸铵盐析及系列柱层析(DEAE-Sepharose、SP-Sepharose和Sephacryl-S-200HR)等方法,从大黄鱼鱼卵中纯化得到该蛋白并经肽指纹质量图谱鉴定其为β′-组分(β′-c)。理化性质分析结果显示,β′-c是一种含糖量为4.2%的糖蛋白,耐酸碱且具有良好的热稳定性;体外模拟胃肠液消化实验中,虽然β′-c较易被胃蛋白酶水解,但其消化产物仍具有免疫反应性,而相比之下,它对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶具有较强的耐受性。采用自行制备的兔抗大黄鱼鱼卵β′-c多克隆抗体与鲤鱼鱼卵、蟹黄、鸡蛋等其他13种动物卵黄蛋白粗提物进行免疫交叉反应实验。结果显示,β′-c是鱼类鱼卵中特有的蛋白。此外,采用阳性混合血清池与8种鱼类卵黄蛋白粗提物进行抑制性ELISA分析。结果表明,不同来源的鱼卵之间,其过敏蛋白虽然均存在较强的免疫交叉反应但也存在一定的差异。利用美拉德反应及3种物理加工方式(紫外照射、超声联合加热、高温高压)处理大黄鱼鱼卵及β′-c,随后提取卵黄蛋白粗提物,并对其及β′-c进行模拟胃肠液二相消化实验。结果表明,美拉德反应能明显降低大黄鱼鱼卵过敏原的IgG/IgE结合活性,超声联合加热和高温高压处理能降低其消化产物的IgG/IgE结合活性。在此基础上,开发了一种利用美拉德反应结合高温高压处理加工鱼子罐头的方法。通过该方法制成的鱼子罐头中,鱼卵过敏原的IgE结合活性较低。此外,本实验利用25份大黄鱼鱼精过敏患者血清,通过ELISA和Western-blotting分析确定了大黄鱼鱼精中的主要过敏原为12kDa的蛋白组分。采用硫酸酸解、乙醇沉淀及Sephacryl-S-200HR柱层析等方法,从大黄鱼鱼精中分离得到12kDa及分子量相近的多组分蛋白,经圆二色光谱分析确定其为鱼精蛋白。理化性质分析结果显示,鱼精蛋白是一种含糖量为2.5%,含有O-糖苷键,耐酸碱且具有良好热稳定性的碱性蛋白。利用RP-HPLC对3种鱼类鱼精蛋白的组分进行分析,结果显示,鲑鱼、鲱鱼及大黄鱼鱼精蛋白中分别含有4、3、6个组分。随后通过Quick flow heparin affinity gel柱层析对大黄鱼鱼精蛋白中的6个组分进行分离并采用Dot-blotting分析其与血清的IgE结合活性。结果发现,仅有分子量为12kDa的组分5能与超过半数的血清发生免疫反应。采用不同鱼类及大黄鱼中不同组分的鱼精蛋白对5种常见微生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、沙门氏菌)进行抑菌实验。结果发现,与山梨酸钾相比,鱼精蛋白对革兰氏阳性菌的抑制效果较好。此外,大黄鱼鱼精蛋白中的6个组分对细菌均有不同程度的抑制作用,其中组分5对革兰氏阳性菌的抑制效果最好,组分6对革兰氏阴性菌的抑制效果最好。本文以大黄鱼鱼卵和鱼精为研究对象,在确定其过敏蛋白的基础上,完成主要过敏原的分离纯化、鉴定及理化性质分析。探究不同物种间过敏蛋白的免疫交叉反应性,为过敏原的安全控制奠定良好基础。探讨不同加工方式对大黄鱼鱼卵过敏原免疫反应性的影响,发明了一种低过敏性鱼子罐头的加工方法;比较大黄鱼中不同组分鱼精蛋白的抑菌性,确定了6种组分对5种常见微生物的抑菌效果,为开发低过敏甚至无过敏性的鱼类加工副产品提供了技术依据。
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