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目的：在前期工作的基础上，进一步提高人类精子蛋白质2-D电泳图谱的分辨率，建立pH值从3.5到9.0的2-D人类正常精子蛋白质参照图谱。
材料和方法：收集已被证明具正常生育能力的12位志愿者的正常精液标本，每人捐献5次，所有志愿者都签署了供精知情同意书。
运用Pereoll密度梯度离心技术分离精子，硫脲／尿素法结合超声法提取蛋白，2-D技术进行人类精子蛋白质分离。2-D第一向为固相pH梯度等电聚焦，分别使用不同pH范围胶条(pH 3-10、pH 3.5-4.5、pH 4.0-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0、pH 5.5-6.7和pH6-9)。第二向为12.5％SDS-PAGE垂直电泳。图像采用Image master5.0分析软件分析。结合胶内酶解和质谱鉴定技术对不同pH范围2-D图谱的有关蛋白斑点进行同一性身份鉴定，以此作为不同2-D图像整合的地界标，再由分析软件对2-D图谱进行计算机处理，获得人类正常精子蛋白质整合参考图谱。
结果：本实验采用了宽范围pH(pH 3～10)，较窄范围(pH 6-9)以及跨度为一个pH单位的重叠窄范围(pH 3.5-4.5、 pH 4.O-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0和pH 5.5-6.7)固相胶条，用Imagemaster 5.O分析软件分别对所有pH范围的2.D图谱进行蛋白点的检测，在相同检测参数下，在所有pH范围的2．D图谱上的检测到的点分别为：1306(pH 3-10)、168(pH 3.5-4.5)、572(pH 4.O-5.0)、1463(pH 4.5-5.5)、1370(pH 5.0-6.0)、1121(pH 5.5-6.7)和1061(pH 6-9)。选取适当的蛋白点当作计算机合成参照图谱的地界标进行酶解以及质谱分析。用软件删除重复的蛋白，最后合成了一张pH值从3.5到9.0的具有3872点人类正常精子蛋白质的2-D参照图，蛋白点的数目将近是pH 3-10 2-D图谱上蛋白的3倍。
结论：本实验首次获得了人类正常精子全蛋白的整合参考图谱，我们共得到了3872点不同的人类正常精子蛋白质，根据我们所查的相关文献，这个数目是迄今为止是最多的。这项工作能为全面地系统地建立人类正常精子蛋白质数据库奠定基础。