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局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是儿童和成人肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)常见的肾小球疾病，是导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因之一，而足细胞病变是FSGS的主要病理表现。足细胞是一种高度分化的肾脏实质细胞，与肾小球内皮细胞以及基底膜共同构成肾小球的滤过屏障，维持肾脏的滤过功能。因此寻找有效的治疗和改善足细胞损伤的靶点具有非常重要的意义。 近年来的研究表明，表观遗传修饰在局灶节段性肾小球硬化中起到重要作用。其中以乙酰化为代表的组蛋白修饰受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化修饰是由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase，HAT）与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)共同调控。组蛋白去乙酰化酶在人体中共发现18种，分为四个亚家族。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类是Zn2+依赖性的组蛋白去乙酰化酶，而Ⅲ类亚家族，也就是Sirtuin家族，其酶活性依赖于NAD+水平。SIRTs家族包括7个成员Sirt1-Sirt7。虽然已有研究表明Sirt1可以通过抗凋亡、抗炎症等方式发挥肾脏保护作用，但是SIRTs家族在局灶节段性肾小球硬化中的作用尚未报道。 研究目的： 1.明确SIRTs家族各成员在局灶节段性肾小球硬化中的表达模式，并进一步探讨Sirt6是否参与局灶节段性肾小球硬化中的足细胞损伤。 2.初步阐明Sirt6在局灶节段性肾小球硬化足细胞损伤中的保护作用及机制。 研究方法和结果： 第一部分:Sirt6在局灶节段性肾小球硬化中的表达和作用 1.Sirt6在局灶节段性肾小球硬化肾脏中的表达 通过小鼠尾静脉注射阿霉素(adriamycin，ADR)构建阿霉素肾病小鼠模型，作为局灶节段性肾小球硬化动物模型。通过利用蛋白免疫印迹(western blot，WB)检测Sirt1-Sirt7在阿霉素肾病小鼠肾脏皮质中蛋白表达变化。结果显示在阿霉素肾病小鼠肾脏中Sirt1、Sirt5以及Sirt6的表达水平出现不同程度的下降。利用免疫荧光(immunofluorescence，IF)实验检测阿霉素肾病小鼠的足细胞中Sirt6的表达变化。结果显示Sirt6在阿霉素肾病肾脏足细胞中的表达水平显著下降。 2.在体外培养的各种肾脏实质细胞中检测ADR刺激下Sirt6的蛋白表达变化 体外培养人源足细胞(human podocyte cell，HPC)、肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell，GENC)、系膜细胞(mesangial cell，MC)以及肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular cell，HK-2)分别给予ADR刺激24小时后，抽提细胞内蛋白，进行WB分析，检测在ADR刺激下Sirt6在各种肾脏实质细胞中的蛋白表达变化。结果显示，足细胞中Sirt6的表达水平显著下降，内皮细胞、肾小管上皮细胞中Sirt6的表达也出现不同程度的下降，系膜细胞中Sirt6的表达没有明显变化。 3.足细胞特异性敲除Sirt6的小鼠的构建 利用Cre-Loxp系统构建足细胞特异性敲除Sirt6（Cre+/Sirt6fl/fl）的小鼠，通过提取鼠尾DNA基因型鉴定确证敲除小鼠的构建成功;另外，利用肾小球分离技术对敲除小鼠进行肾小球分离，然后采用Real-time RT-PCR检测肾小球内Sirt6的mRNA水平，结果显示在足细胞Sirt6特异性敲除小鼠的肾小球中Sirt6的mRNA水平明显下降。 4.足细胞敲除Sirt6加重阿霉素肾病小鼠足细胞损伤 C57BL/6J野生雄性小鼠与足细胞特异性敲除Sirt6（Cre+/Sirt6fl/fl）雄性小鼠随机分为四组，构建FSGS动物模型。检测尿白蛋白/肌酐比值，并进行PAS染色。结果显示足细胞特异性敲除Sirt6加重阿霉素肾病的肾脏损伤。透射电镜结果显示敲除Sirt6加重阿霉素肾病小鼠足突的融合、脱落。IF标记足细胞的裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin，结果显示敲除足细胞Sirt6明显下调阿霉素肾病足细胞中Nephrin和Podocin表达水平。 5.Sirt6改善阿霉素肾病足细胞损伤 通过肾脏注射Sirt6慢病毒表达载体，检测肾小球Sirt6mRNA水平，从而确认过表达Sirt6动物模型构建成功。构建阿霉素肾病模型后，检测小鼠尿白蛋白/肌酐比值并进行PAS染色。结果显示过表达Sirt6减轻阿霉素肾病肾脏损伤。透射电镜观察足细胞形态，结果显示过表达Sirt6减轻阿霉素肾病足突的融合、脱落，改善足细胞损伤。IF观察不同处理组小鼠足细胞特异性蛋白Nephrin和Podocin蛋白表达水平，结果表明过表达Sirt6可上调阿霉素肾病小鼠足细胞中Nephrin和Podocin的表达水平。体外实验，WB检测裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达水平，结果显示过表达Sirt6可逆转阿霉素诱导的Nephrin和Podocin表达水平的下降。流式细胞术检测足细胞凋亡，结果表明过表达Sirt6抑制阿霉素诱导的足细胞凋亡。 第二部分:Sirt6改善阿霉素肾病足细胞损伤的作用机制 1.检测Sirt6对足细胞中Notch1和Notch4表达的影响 通过IF双染方法检测敲除Sirt6后对阿霉素肾病小鼠足细胞内Notch1和Notch4的蛋白水平的影响。结果显示，敲除Sirt6后，阿霉素肾病小鼠足细胞内Notch1和Notch4表达明显升高。进一步通过免疫荧光实验发现过表达Sirt6可明显抑制ADR Cre+/Sirt6fl/fl小鼠足细胞中Notch1和Notch4的表达。 2.检测过表达Sirt6对Notch信号通路的影响 WB结果显示过表达Sirt6可抑制阿霉素诱导的足细胞Notch1和Notch4的蛋白表达。同时过表达Sirt6抑制Notch信号通路下游靶基因HES1和Snail1的蛋白表达。因此Sirt6通过负调控Notch信号通路从而改善FSGS足细胞损伤。 研究结论： 1.本研究首次证实Sirt6在阿霉素诱导的FSGS小鼠模型中表达明显下调，进一步研究发现足细胞特异性敲除Sirt6加重FSGS足细胞损伤，过表达Sirt6改善FSGS足细胞损伤。 2.Sirt6可能通过负调控Notch信号通路改善FSGS足细胞损伤。本研究有助于进一步阐明FSGS肾脏损伤的病理生理学机制，为设计和开发针对Sirt6的相关药物并将其应用于FSGS的防治中提供了重要的实验基础和理论依据。