【摘 要】
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目的:构建睾丸支持细胞和精原细胞特异表达的2种可诱导型Cre工具鼠 方法:通过设计合成引物PCR扩增出AMH和STRA8的启动子,用EcoR I和Spe I酶切后连接到同样用EcoR I和Spe I酶切的载体PCAG-ERT2-CRE-ERT2上。成功构建的质粒AMH-ERT2-CRE-ERT2和STRA8-ERT2-CRE-ERT2再用Spe I酶切纯化回收线性化的DNA片段,稀释成2
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目的:构建睾丸支持细胞和精原细胞特异表达的2种可诱导型Cre工具鼠 方法:通过设计合成引物PCR扩增出AMH和STRA8的启动子,用EcoR I和Spe I酶切后连接到同样用EcoR I和Spe I酶切的载体PCAG-ERT2-CRE-ERT2上。成功构建的质粒AMH-ERT2-CRE-ERT2和STRA8-ERT2-CRE-ERT2再用Spe I酶切纯化回收线性化的DNA片段,稀释成2ng/μl的注射用DNA溶液。将其用显微注射的方法直接注入超排得到的C57BL/6受精卵的原核内,体外培养1-2小时后,移植到假孕ICR母鼠的输卵管内。待其怀孕产仔后,抽提鼠尾DNA,用PCR法检测仔鼠是否为转基因阳性小鼠。 结果:成功构建了可诱导型AMH-ERT2-CRE-ERT2和STRA8-ERT2-CRE-ERT2载体质粒。AMH的DNA一共注射了205个受精卵。将180个存活的受精卵移植到9只假孕ICR母鼠的输卵管内,共得到94只仔鼠。PCR检测表明9只为转基因阳性小鼠。STRA8的DNA一共注射了164个受精卵。将147个存活的受精卵移植到7只假孕ICR母鼠的输卵管内,共得到58只仔鼠。PCR检测表明8只为转基因阳性小鼠。 结论:用原核注射法成功制备出了睾丸支持细胞和精原细胞特异表达、可诱导型Cre重组酶转基因工具小鼠C57BL/6 FVB-Tg（AMH-ERT2-CRE-ERT2）和C57BL/6 FVB-Tg（STRA8-ERT2-CRE-ERT2） 背景＆目的:HRB2（HIV-1 rev binding protein 2）是一个由381个氨基酸残基组成的蛋白质,其对应基因全长3357bp,有一个长度为1143bp的开放阅读框架。HRB2蛋白在多种真核生物中存在同源蛋白。对这些同源蛋白的研究发现,HRB2蛋白参与广泛的生命活动,如参与核糖体合成、介导蛋白与蛋白间相互作用和在亚细胞中的定位等。目前对HRB2的研究在酵母中的研究比较深入,取得了很多成果,但对人源的HRB2的研究很少。本研究通过对人源HRB2的蛋白结构分析、同源比对、亚细胞定位、在传代细胞中的表达、RNA干扰以及对细胞周期的影响、HRB2与NYD-SP14的相互作用等研究,初步阐明人源HRB2的功能。 方法:通过生物信息学软件分析比较HRB2与其同家族蛋白序列的相似性,分析其功能结构域,推测其功能;通过RT-PCR分析HRB2在常用传代细胞系中的表达;通过构建表达绿色荧光与HRB2融合蛋白的质粒,用激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位情况;设计并构建HRB2蛋白的RNA干扰质粒并抑制内源HRB2蛋白的表达,筛选合适的干扰质粒,通过划痕愈合实验、绘制生长曲线以及流式细胞分析研究HRB2基因对细胞周期的影响;共定位研究HRB2与NYD-SP14的相互作用及复合体在细胞中的定位。 结果:HRB2在许多物种中存在,在不同的物种间具有高度的保守性。通过蛋白结构域分析发现HRB2蛋白中含有一个KH（hnRNP K homology domain）结构域,该结构域在真核生物中广泛并参与很多重要的生物功能。RT-PCR发现HRB2在Hela、293T、HEKTER等培养的细胞系中均有表达。在多种培养细胞系的研究中发现,HRB2定位在细胞核核仁位置上。我们设计了四种携带HRB2蛋白特异干扰序列的的RNA干扰质粒,通过用Real-Time PCR的方法验证它们对内源HRB2蛋白表达的抑制作用,结果表明二号和四号干扰质粒对内源HRB2的干扰效果较好。划痕愈合实验和绘制生长曲线的结果显示二号和四号靶点细胞株细胞生长受到抑制,但流式细胞分析的结果没有差异。细胞内源性NYD-SP14弥散分布在胞浆中,而免疫荧光实验分析说明在过表达HRB2的细胞中,NYD-SP14在胞浆中的含量明显降低,而和HRB2蛋白在核仁内形成复合体。 结论:HRB2在多种生物中广泛表达且存在高度同源性。在传代细胞中,HRB2蛋白定位在核仁上。我们成功构建并筛选了携带有人HRB2基因的shRNA慢病毒载体及有效靶点,研究发现HRB2基因对细胞周期产生了影响。另外,HRB2与NYD-SP14之间有相互作用,HRB2/NYD-SP14蛋白复合体主要定位在核仁。
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