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紫杉醇是一种高效、低毒、广谱的抗癌药物,与其他药物配合使用对癌症有极好的疗效。但因其在红豆杉中含量极低,市场供不应求,提高紫杉醇的产量是目前亟需解决的重要问题。TGA转录因子是碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)TF家族中GroupD成员之一,广泛参与植物抗逆、器官发育、次生代谢产物合成等各生理过程。本研究利用转录组数据,鉴定了红豆杉中TGA类转录因子,并对其调控紫杉醇合成的作用及机制进行了研究,为利用生物技术手段构建(或筛选)紫杉醇高产红豆杉细胞系/植株提供基因材料和理论指导。取得的主要成果如下:
(1)利用组学数据,通过同源筛选的方法,共筛选获得12个红豆杉TGA转录因子,并命名为TcTGA1-12。其中,仅有TcTGA1-10具有编码完整TGA因子的能力。对TcTGA1-10的蛋白序列进行分析后发现,这10个TcTGA均为亲水性蛋白质,具有较高的热稳定性和不同的酸碱性等电点。TcTGA1-10均具有蛋白磷酸化位点,且数量最多的是丝氨酸,苏氨酸次之,而酪氨酸最少。TcTGA1-10蛋白N端均含有核定位信号及保守的bZIPdomain,且C端含有2个glutamine-richQ1和Q2结构域,表明TcTGA1-10均为典型的TGA类转录因子。此外,TcTGA1-10蛋白二级结构的主要形成方式是ɑ-螺旋和无规则卷曲,暗示着TcTGA空间结构预测较小且稳定。
(2)TcTGAs因子与拟南芥TGAs因子具有进化差异。TcTGAs可分为4类,分别是I+III类、IV类、V类和VI类,与拟南芥AtTGAs相比,增加了VI类,缺少II类。进一步结合玉米、水稻、苹果、葡萄、番茄、马铃薯和番木瓜进行系统进化分析后发现,在裸子植物进化为被子植物过程中存在TGA转录因子分支的产生与消失——II类TGA转录因子分支出现,I+III类TGA进一步分支,部分物种的VI类TGA则丢失。
(3)TcTGAs因子在紫杉醇的骨架合成及羟化过程中发挥不同的调控作用,进而影响紫杉烷类产物的合成。TcTGA3对T13H和ERF12基因的表达发挥负调作用,TcTGA7对T10H、T13H和ERF12基因的表达发挥负调作用,TcTGA9负调T10H、ERF12基因的表达,其中T10H和T13H的表达受到它们的严格调控。而TcTGA10因子则正向调控TS、T5H、T10H基因的表达。TcTGA3和TcTGA9主要对10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰紫杉醇、紫杉醇和7-表-紫杉醇发挥负向调控作用;TcTGA7转录因子主要对巴卡亭III、7-表-紫杉醇和紫杉醇的合成发挥负向调控作用;而TcTGA10转录因子对10-去乙酰紫杉醇、7-表-紫杉醇和紫杉醇的合成均发挥正向调控作用,对7-表-10-去乙酰紫杉醇的合成发挥了负向调控。
(4)TcTGA3、TcTGA7、TcTGA10可能是SA信号转导通路调控紫杉醇合成的直接调控因子。TcTGA3/7/10均可以与TcNPR1互作,且可与靶基因紫杉醇合成酶基因启动子上的顺式作用元件TGACG-motif相互作用。
(1)利用组学数据,通过同源筛选的方法,共筛选获得12个红豆杉TGA转录因子,并命名为TcTGA1-12。其中,仅有TcTGA1-10具有编码完整TGA因子的能力。对TcTGA1-10的蛋白序列进行分析后发现,这10个TcTGA均为亲水性蛋白质,具有较高的热稳定性和不同的酸碱性等电点。TcTGA1-10均具有蛋白磷酸化位点,且数量最多的是丝氨酸,苏氨酸次之,而酪氨酸最少。TcTGA1-10蛋白N端均含有核定位信号及保守的bZIPdomain,且C端含有2个glutamine-richQ1和Q2结构域,表明TcTGA1-10均为典型的TGA类转录因子。此外,TcTGA1-10蛋白二级结构的主要形成方式是ɑ-螺旋和无规则卷曲,暗示着TcTGA空间结构预测较小且稳定。
(2)TcTGAs因子与拟南芥TGAs因子具有进化差异。TcTGAs可分为4类,分别是I+III类、IV类、V类和VI类,与拟南芥AtTGAs相比,增加了VI类,缺少II类。进一步结合玉米、水稻、苹果、葡萄、番茄、马铃薯和番木瓜进行系统进化分析后发现,在裸子植物进化为被子植物过程中存在TGA转录因子分支的产生与消失——II类TGA转录因子分支出现,I+III类TGA进一步分支,部分物种的VI类TGA则丢失。
(3)TcTGAs因子在紫杉醇的骨架合成及羟化过程中发挥不同的调控作用,进而影响紫杉烷类产物的合成。TcTGA3对T13H和ERF12基因的表达发挥负调作用,TcTGA7对T10H、T13H和ERF12基因的表达发挥负调作用,TcTGA9负调T10H、ERF12基因的表达,其中T10H和T13H的表达受到它们的严格调控。而TcTGA10因子则正向调控TS、T5H、T10H基因的表达。TcTGA3和TcTGA9主要对10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰紫杉醇、紫杉醇和7-表-紫杉醇发挥负向调控作用;TcTGA7转录因子主要对巴卡亭III、7-表-紫杉醇和紫杉醇的合成发挥负向调控作用;而TcTGA10转录因子对10-去乙酰紫杉醇、7-表-紫杉醇和紫杉醇的合成均发挥正向调控作用,对7-表-10-去乙酰紫杉醇的合成发挥了负向调控。
(4)TcTGA3、TcTGA7、TcTGA10可能是SA信号转导通路调控紫杉醇合成的直接调控因子。TcTGA3/7/10均可以与TcNPR1互作,且可与靶基因紫杉醇合成酶基因启动子上的顺式作用元件TGACG-motif相互作用。