论文部分内容阅读
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)是一类重要的细胞膜受体家族，它们通过感知不同的胞外信号介导胞內多种生理应答。已知的GPCR均含有七次跨膜螺旋结构域(seven transmembrane domain, 7TM)，基于受体这一共同结构的序列相似性，GPCR可分为4个家族。钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)属于C类GPCR家族成员，在体内以同源二聚体的形式行使功能，其中每个单体包括捕蝇夹结构域(Venus flytrap domain, VFT)、半胱氨酸富集区(cysteine-rich domain, CRD)、七次跨膜螺旋结构域和胞內C端结构域(intracellular domain, ICD)。已有的晶体学结构与功能性研究表明，CaSR二聚体在激活过程中发生了大规模的构象变化，激动剂与VFT的结合使二聚体亚基之间形成紧实的二聚体作用界面，拉近了二聚体间CRD的距离，从而将信号从胞外VFT传递至跨膜结构域，最终活化细胞膜内G蛋白。虽然CaSR二聚体胞外区在激活态和非激活态的晶体结构已经得到了解析，但CaSR二聚体跨膜区结构还未报道，受体二聚体跨膜区结构域在激活过程中发生的构象变化仍不清楚。
基于CuP催化的半胱氨酸交联和SNAP特异性标记的FRET方法，我们检测了CaSR激活过程中跨膜结构域的构象变化规律。研究发现，CaSR二聚体七次跨膜区中TM4、TM5界面的锁定减弱了激动剂诱导FRET信号下降的能力，而预孵育激动剂能够减弱这种抑制作用，表明TM4、TM5界面的锁定能够抑制激动剂诱导的CaSR胞外区的构象变化。相反，锁定TM6界面可使受体在没有激动剂作用的情况下呈现出低FRET信号，受体胞外区呈激活构象，同时预孵育激动剂能够增强这一效应。此外，TM4界面的锁定使正向变构调节剂(positive allosteric modulator, PAM)丧失增强激动剂效应的能力，TM6界面的锁定则使负向变构调节剂(negative allosteric modulator, NAM)丧失抑制激动剂效应的能力。综合以上结果表明，TM4、TM5组成了CaSR二聚体的非激活界面，TM6则组成了CaSR二聚体的激活界面。我们进一步对二聚体的交联情况进行了检测，证实CaSR二聚体的相互作用界面是由TM4、TM5、TM6组成，非激活状态下CaSR二聚体作用界面由TM4、TM5组成。
最后，我们锁定CaSR二聚体七次跨膜区的界面，对CaSR二聚体下游功能进行了研究。结果表明，当二聚体间TM4或TM5界面锁定时，激动剂对受体的激活受到明显抑制。相反，当我们将TM6界面锁定时，突变体受体呈组成型激活，预孵育激动剂还可增强受体的这一组成型活性。这些结果进一步证明了CaSR同源二聚体七次跨膜区在激活过程中从TM4、TM5组成的非激活界面转动到TM6组成的激活界面。
综上所述，我们基于半胱氨酸交联的方法从胞外区构象变化、蛋白交联和受体功能多个方面首次揭示了CaSR二聚体七次跨膜区在激活过程中从TM4、TM5组成的非激活界面转动到TM6组成的激活界面，证实七次跨膜区TM6的转动对受体激活的重要性，为位于TM6上天然致病性突变体的作用机制提供了参考。
基于CuP催化的半胱氨酸交联和SNAP特异性标记的FRET方法，我们检测了CaSR激活过程中跨膜结构域的构象变化规律。研究发现，CaSR二聚体七次跨膜区中TM4、TM5界面的锁定减弱了激动剂诱导FRET信号下降的能力，而预孵育激动剂能够减弱这种抑制作用，表明TM4、TM5界面的锁定能够抑制激动剂诱导的CaSR胞外区的构象变化。相反，锁定TM6界面可使受体在没有激动剂作用的情况下呈现出低FRET信号，受体胞外区呈激活构象，同时预孵育激动剂能够增强这一效应。此外，TM4界面的锁定使正向变构调节剂(positive allosteric modulator, PAM)丧失增强激动剂效应的能力，TM6界面的锁定则使负向变构调节剂(negative allosteric modulator, NAM)丧失抑制激动剂效应的能力。综合以上结果表明，TM4、TM5组成了CaSR二聚体的非激活界面，TM6则组成了CaSR二聚体的激活界面。我们进一步对二聚体的交联情况进行了检测，证实CaSR二聚体的相互作用界面是由TM4、TM5、TM6组成，非激活状态下CaSR二聚体作用界面由TM4、TM5组成。
最后，我们锁定CaSR二聚体七次跨膜区的界面，对CaSR二聚体下游功能进行了研究。结果表明，当二聚体间TM4或TM5界面锁定时，激动剂对受体的激活受到明显抑制。相反，当我们将TM6界面锁定时，突变体受体呈组成型激活，预孵育激动剂还可增强受体的这一组成型活性。这些结果进一步证明了CaSR同源二聚体七次跨膜区在激活过程中从TM4、TM5组成的非激活界面转动到TM6组成的激活界面。
综上所述，我们基于半胱氨酸交联的方法从胞外区构象变化、蛋白交联和受体功能多个方面首次揭示了CaSR二聚体七次跨膜区在激活过程中从TM4、TM5组成的非激活界面转动到TM6组成的激活界面，证实七次跨膜区TM6的转动对受体激活的重要性，为位于TM6上天然致病性突变体的作用机制提供了参考。