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热休克蛋白gp96（又称作GRP94）是hsp90家族的一员，与细胞质中的hsp90具有50％的同源性。它主要存在于内质网中，也有一部分位于癌细胞的膜表面。与其它热休克蛋白一样，gp96的主要生物学功能是分子伴侣的功能，它参与蛋白的折叠、转运、降解及多聚体的组装等。gp96可以特异性结合抗原肽，增强抗原呈递的特性使其作为一种新型免疫佐剂被广泛应用于细菌及流感、人乳头瘤病毒、艾滋病、乙型肝炎等病原感染的研究中。越来越多的研究发现gp96在肿瘤的发生发展中，肿瘤细胞的快速生长会导致肿瘤缺氧、缺血及局部酸中毒，这些应激条件刺激肿瘤组织表达产生包括gp96在内的许多热休克蛋白，热休克蛋白可能作为分子伴侣来调节肿瘤的不断增殖从而使肿瘤细胞克服各种不利的生理环境。并且gp96的表达与肿瘤的发生，发展及细胞分化呈现相关性。同样gp96在一些致病菌包括病毒的入侵，胞内扩增等过程中发挥重要作用。因此，获得特异性结合gp96的抗体检测gp96的表达，同时采用抗体靶向中和gp96来抑制与其有关疾病如肿瘤的发生，都有很重要的意义。 目的:本文利用毕赤酵母分泌表达gp96-scFv抗体，纯化后得到能特异性结合gp96抗原的小分子抗体片段(scFv)。方法:根据文献报道的gp96-scFv抗体基因序列，合成gp96-scFv抗体基因序列，将gp96-scFv抗体序列克隆到毕赤酵母表达质粒pPICZα-A，线性化的重组表达载体电转化到毕赤酵母X33，甲醇诱导目的蛋白表达，通过亲和层析法纯化目的蛋白，并以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。通过Western blot、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法对gp96-scFv抗体的生物活性进行了检测。结果:成功地构建了分泌表达抗gp96蛋白scFv抗体的毕赤酵母菌，每升毕赤酵母菌培养上清经纯化可获约50mg gp96-scFv抗体，所获抗体其分子量大约为15kDa。具有与gp96抗原特异性结合的活性。结论:本研究利用毕赤酵母菌成功表达了重组gp96-scFv抗体，生物活性Westernblot、Immunofluorescence、ELISA、FACS分析表明该抗体能特异性结合gp96。