【摘 要】
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[目的]：探讨蚊(Mosquito)扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）的主要影响因素，即DNA模板制备、酶切反应、连接反应、预扩增反应和选择性扩增反应的关键
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[目的]：探讨蚊(Mosquito)扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）的主要影响因素，即DNA模板制备、酶切反应、连接反应、预扩增反应和选择性扩增反应的关键步骤，建立并优化蚊AFLP反应体系。筛选适合AFLP体系进一步研究应用的选择性引物组合
[方法]：以淡色库蚊成蚊为研究材料，用酚-氯仿抽提蚊基因组DNA，DU730检测浓度和纯度，利用线粒体CoiA基因设计引物进行PCR扩增、纯化、测序和Blast比对，从基因水平验证模板来源;酶切反应的37℃温育分为lh、2h、3h、4h，2.0％琼脂糖凝胶电泳检测;连接反应16℃温育2h、3h、过夜;将不同温育时间的连接产物分别稀释5倍、10倍、20倍，分组进行预扩增反应，2.0％琼脂糖凝胶电泳检测;将预扩增产物稀释5倍、10倍、20倍进行选择性扩增反应，以及调整选扩循环数后选择性扩增反应，2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。将优化后的AFLP体系再次扩增，EcoRI的8条上游引物分别与MseI的50条下游引物组合，选择性扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳初步选取带型质量好、分辨率高、多态性好的引物组合;荧光标记EcoRI的8条上游引物，将选取的引物组合选择性扩增后经高效毛细管电泳二次筛选适合本研究应用的引物对。
[结果]：蚊基因组DNA提取效果，OD260/OD280比值接近1.8，浓度＞400μg/ml，登录NCBI在GenBank数据库内比对PCR扩增产物的同源性为99％～100％;酶切反应的37℃最适温育时间为3h，弥散带分布均匀;预扩增产物的电泳结果显示，温育时间长短对连接反应无明显影响，将连接产物稀释10倍是理想的预扩增模板;预扩增产物稀释10倍及25个循环时，可获得清晰的多态性条带。经2.0％琼脂糖电泳和高效毛细管电泳筛选出80个引物对，多态性条带有十几条至150条以上。
[结论]：蚊AFLP反应体系的建立与优化和选择性扩增引物组合的筛选，为进一步研究蚊虫的遗传多样性、遗传图谱的构建和基因定位等方面提供了有力的技术支持。
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