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环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，E.C.2.4.1.19，简称CGT酶)作用下生成的以α-1，4糖苷键相连的环状低聚糖的总称。因其疏水内腔和亲水外缘的特殊结构，可以和一系列客体分子形成包合物并提高客体分子的水溶性和稳定性等理化特性，被广泛应用于食品、化妆品和制药行业中。由于CGT酶的产物多为环糊精的混合物，分离纯化过程复杂，因此提高CGT酶产物选择性的研究受到了越来越多的关注。 为了提高源自软化类芽孢杆菌Paenibacillusmaceranssp.602-1的α-CGT酶生成γ-CD的能力，对其活性区域位点分别进行如下突变:K47T(-3亚位点)，L194T(+1亚位点)，Y195I(环化中心)以及146-152位氨基残基替换为异亮氨酸(命名为Δ6)(-7亚位点)，分析其底物专一性的变化。结果表明，相比野生酶，所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面，突变酶Y195I的催化产物中，α-CD的比例由68％降为30％，β-CD由22.2％提高为33.3％;而γ-CD由8.9％提高为36.7％，在产物中的比例提高了4倍，取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1g/L，是野生酶(0.4g/L)的3倍。突变酶K47T和Δ6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降，但仍然是产物中的主要组分，而β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见，Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。突变酶Y195I的酶学性质研究表明，最适反应温度和野生酶相同，最适反应pH有所提高，且比野生酶具有更好的pH稳定性。 根据上述实验结果，对含Y167H突变的α-CGT酶(α-CD比例相比野生型提高，以下简称为Y195突变酶)的195位酪氨酸进行饱和突变，进一步研究195位氨基酸的种类对于催化专一性的影响。结果表明，所有突变酶中除Y195F突变酶和Y195突变酶的酶学性质类似外，其余突变酶淀粉降解能力和环糊精生成能力都不同程度下降。其中突变酶Y195R和Y195K的产物中，α-CD的比例由83％分别降为35％和38％，β-CD由10％升至15％和18％，而γ-CD由7％分别升至50％和44％，其中γ-CD成为主要产物，但是由于总CD产量很低，γ-CD的绝对量仍然较低分别为0.7g/L和0.6g/L是Y195突变酶(0.3g/L)的两倍。Y195I与Y195L的产物中α-CD的比例由83％分别降为28％和28％，β-CD由10％升至34％和36％，而γ-CD由7％分别升至38％和36％，其中β-和γ-CD成为主要产物，γ-CD的绝对产量为1.2g/L，是Y195的4倍。突变酶中Y195I和Y195R的热稳定性较Y195突变酶有所提高。195位的Tyr和Phe对于α-CGT酶的淀粉降解能力和环化活性有十分重要的作用。当195位为Lys和Arg时β-CD成为三种产物中比例最低的一种，这在已有的研究中较少见。195位为Ile和Leu时α-CD在产物中比例最低，产物有向大环环糊精转移的趋势，这和上文的研究基本一致。 接下来对突变酶Y195I进行了结晶研究，可以从结构层面解释突变酶选择性改变的原因。通过初筛获得了针形CGT酶晶体，同时通过优化结晶条件获得了梭形的高质量CGT酶单晶。在同步辐射光源上收集自由态CGT酶晶体的X射线衍射数据，分辨率最高可达2.15(A)。为下一步解析结晶数据做好准备。 为了从分子动力学角度解释Y195I突变酶的作用机制，分别计算了野生CGT酶和Y195I突变CGT酶与糖链分子复合物的运动轨迹。结果发现195位Tyr突变成Ile后蛋白质RMSD变化更小，蛋白质结构比突变前更稳定，这可以解释Y195I突变酶比野生酶具有更好的温度稳定性。当195位Tyr突变成Ile后糖链RMSD变化更大并且在长时间计算后很难恢复到原来的位置，这解释了为何产物专一性发生了很大的变化。