耐热酵母Kluyveromyces marxianus中Hog1与Fps1功能的初步研究

• 作 者: 殷勤
• 机 构: 华东理工大学
• 出 处: 华东理工大学
• 发表日期: 2009年期
• 关键词: 乙酸 发酵工艺 hog1 fps1 基因敲除

促分裂原蛋白激酶Hog1和水甘油通道蛋白Fps1在很大程度上决定酵母对乙酸的耐受性。耐热酵母Kluyveromyces marxianus已被用于工业乙醇发酵生产，还具有用于纤维素发酵乙醇的潜力。研究K. marxianus中Hog1与Fps1功能不仅能有助于深入理解细胞对乙酸的耐受性机制，还可为获得耐乙酸菌株提供指导。
根据几种真菌的保守氨基酸序列设计简并引物，从耐热酵母K. marxianus基因组DNA中扩增出Hog1同源基因的部分片段，进一步利用染色体步移技术延伸该片段的上下游邻接序列，首次获得Kmhog1(2.338 kb，GenBank登录号：EU625288)。序列分析表明Kmhog1基因编码465个氨基酸的多肽，推测其分子量为52.8kDa，等电点为5.21。KmHog1含有Hog1 MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY)。进而利用同源重组方法敲除K. marxianus Kmhog1，分析Kmhog1缺失对菌株抗逆能力的影响。实验结果显示Kmhog1缺失突变体对乙酸胁迫、高渗透压胁迫以及H2O2诱导的氧化胁迫的敏感性都增加，表明在K. marxianus中Hog1与逆境因子胁迫调节相关。但高温胁迫对hog1△菌株的影响不大。
同时，从耐热酵母K.marxianus中克隆了Kmfps1，利用同源重组的方法敲除K。marxianus Kmfps1基因，并分析Kmfps1缺失对菌株在乙酸胁迫下菌体生长和产乙醇的影响。实验结果表明KmFps1缺失突变体对乙酸具有耐受性，在pH为4.5时fps1△菌株表现更明显。当加入乙酸浓度为0.2％，0.3％(V/V)时，fps1△菌株产乙醇量超过原始菌株，分别是原始菌株的1.39和2.41倍；加入乙酸浓度为0.4％(V/V)时，原始菌株已无法生长，而fps1△菌株能够生长，乙醇积累浓度达0.2％(V/V)。