蓖麻遗传转化体系构建及蓖麻毒蛋白基因干扰载体转化研究

• 作 者: 王莹
• 机 构: 内蒙古民族大学
• 出 处: 内蒙古民族大学
• 发表日期: 2011年期
• 关键词: 蓖麻 遗传转化 体系构建 RNAi技术 农杆菌介导 RT-PCR检测

蓖麻作为“绿色石油”,被广泛应用于化工,航空航天等多个领域,其开发具有广泛的前景。但由于蓖麻籽中含有多种剧毒物质,如蓖麻毒蛋白、凝集素等,极大的限制了蓖麻的综合利用。利用RNAi技术,沉默蓖麻毒蛋白基因,改良蓖麻品质,培育低毒的蓖麻品种,为蓖麻分子育种提供新的种质资源,对拓宽蓖麻的综合利用有重要意义。　　
本试验建立了蓖麻遗传转化体系,采用农杆菌介导法,利用蓖麻毒蛋白A链基因所构建的基因沉默双元表达载体,转化通蓖5号蓖麻品种,获得了抗性植株。对所获得的植株,分别从DNA、RNA水平上进行检测,初步判断成功构建了蓖麻遗传转化体系,转化后获得蓖麻毒蛋白A链基因被抑制的植株。主要研究结果如下:　　
1在建立蓖麻高效再生体系的研究中,采用根癌农杆菌转化蓖麻子叶节,成功地将RTA-RNAi基因导入蓖麻。试验中通过蓖麻子叶节再生试验,研究了蓖麻子叶节抗性筛选、根癌农杆菌的侵染浓度、侵染时间、共培养时间、生根培养等因素对蓖麻遗传转化效率的影响。试验结果表明,外植体预培养2d,农杆菌浓度为OD600=0.5为宜。侵染时间为10min最佳。侵染后培养,转移至含有卡那霉素抗性筛选的培养基诱导筛选培养,经过四周的抗性筛选后,获得转基因抗性植株,将获得的抗性植株转接到生根培养基,诱导生根。经过二十天的生根培养。将带有3～5cm的不定根的抗性苗,炼苗移栽,3个月后得到再生植株。　　
2采用CTAB法提取蓖麻基因组DNA,进行目的基因片段PCR扩增,得到290bp目的基因片段,与预期效果一致,将PCR扩增的特异目的片段进行纯化回收,连接载体并转化大肠杆菌感受态,经重组质粒的筛选和鉴定,对纯化后的目的基因片段测序。初步证实外源基因已整合到蓖麻基因组中。采用Trizol法对蓖麻转基因抗性植株进行RNA提取,进行RT-PCR扩增,并没有得到任何片段,对内参基因eef进行RT-PCR扩增,得到109bp目的片段,初步推断,RNAi已沉默蓖麻毒蛋白基因。