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目的：
研究两种不同病毒的气溶胶行为,包括气溶胶内病毒粒级分布、基因拷贝数、活力这三个行为特点的变化,探讨不同温湿度以及紫外线条件下对其行为特点的影响；对该两种常见的由呼吸道传播的病毒的流行病学表现提出科学解释。
方法：
一、病毒储备液的制备以及检测条件的确立。
1.用细胞培养法繁殖法扩增复制缺陷型重组腺病毒(RDRADS),用鸡胚培养法扩增H3N2型猪流感病毒(SIV)。
2.根据Reed-Muench方法对两种病毒滴度进行测定和计算,最终获得两种病毒浓度,调整浓度使之都为105 TCID50。
3.确定间接免疫荧光测定法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测流感病毒的实验条件。
4.用PK15细胞和MDCK细胞对SIV进行检测,选择合适的流感病毒实验细胞。
二、收集不同条件下的混合病毒气溶胶进行分析。
1.混合重组腺病毒气溶胶的发生在250L的钢化玻璃箱中利用TK-3型微生物气溶胶发生器将RDRADS和SIV混合病毒液形成喷雾,暴露在预先设定的实验条件下,等待30min后收集。
2.采样
用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器,类似于国际上通用的6级Andersen微生物采样器对混合气溶胶进行采样。
3.细胞培养(病毒活性测定)采样后的各级平皿内培养液各吸取400μ1同时接种于细胞密度达80％猪肾细胞(PK15)和犬肾细胞(MDCK)的48孔板中,48h后同时用甲醛固定。在LEICADM IRBE荧光倒置显微镜下观察PK15的绿色荧光。对MDCK细胞进行免疫组化后在显微镜下观察红色荧光,照相记录。取3个不同视野进行拍照,采用JD 801形态学图象分析软件进行计数取总值。
4.实时荧光定量PCR(病毒基因组拷贝数测定)分别提取各级采样后平皿中猪流感病毒的RNA和腺病毒的DNA,对猪流感病毒的RNA进行逆转录(RT)后,对其CDNA和腺病毒的DNA进行实时荧光定量PCR检测基因拷贝数。
5.数据分析。
结果：
一、病毒储备液的制备以及检测条件的确立。
1.成功扩增出高浓度的RDRADS和H3N2型SIV。
2.测得扩增出的RSRADS的浓度为105.33 TCID50,而SIV的浓度为105TCID50。调整RASRADS的浓度与SIV相同也为105 TCID50。
3.用棋盘测定法测得SIV荧光免疫组化的一抗最佳作用浓度为1:400,二抗最佳作用浓度为1:200。
4.将SIV和RDRADS病毒同时加入PK15细胞进行检测,发现SIV和RDADS不能同时感染同一个细胞。PK15细胞检测流感病毒不如MDCK细胞灵敏。
二、混合气溶胶实验结果比较及分析。
1.腺病毒在绝大部分条件下,感染细胞数以5级或6级最多,腺病毒的5级或6级与其他粒级基因拷贝数差异显著。流感病毒在大部分情况下,感染细胞数以5级或6级最多,但流感病毒5、6级基因拷贝数与其他粒级无明显差别。提示腺病毒主要分布在第5,6级。而流感病毒分布较平均,但在5,6级感染力强,提示流感病毒在5,6级收集的0.65-2.1μm的气溶胶中活力较强。
2.在低温时(13℃-19℃),腺病毒和流感病毒在低湿度(20％-35％)中活力较强,而在中高湿度(60％-90％)较弱；在温度为21℃-30℃时,两种病毒在低湿度(20％-35％)活力较弱,而在中等湿度(50％-80％)活力较强：在高湿度下(90％-100％),两种病毒活力在本实验的任意温度下均很弱。说明湿度对病毒活性影响很大。
3.紫外线照射对腺病毒活力的影响比流感病毒大,紫外线对流感病毒作用的高峰有可能在最初的5min。紫外线对流感病毒活力的影响主要是在6级,而其他级别活力影响不大。