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精子发生是一个复杂的细胞分化过程。从细胞水平看，能够自我更新的二倍体精原细胞分化为精母细胞，经过减数分裂转化单倍体的精子。从分子水平看，精子发生是一系列基因按照特定的表达模式依次表达，从而精确调控精子发生的正常进行。然而，目前我们对哺乳动物的精子发生分子事件依然知之甚少。在本文中，我们使用了包括分子克隆、多克隆抗体制备、RNAi、精原干细胞的转染和移植、酵母双杂交、CRISPR/CAS9等多种生物学实验技术初步研究了GCSE2、KDM4A和SPATA35三个基因在精子发生过程中的功能。本研究不仅丰富了小鼠精子发生过程中的分子调控机制基础理论，而且有助于理解雄性不育发生机制。 具体研究分为以下三部分: 研究一:新的小鼠生殖细胞特异性表达基因GCSE2的克隆、表达和初步的功能研究。研究结果显示:1.使用生物信息学、RT-PCR、RACE和Wester nblot证明该基因特异性的表达在小鼠睾丸和卵巢。2.使用免疫组化发现该基因特异性表达在多种发育阶段的卵母细胞和精母细胞，证明该基因仅表达在小鼠生殖细胞。3.通过基于piggyBac RNAi载体转染精原干细胞，FACS分选获得稳定克隆后，移植到受体小鼠睾丸中。结果发现敲低GCSE2，有损精子发生。证明该基因参与精子发生过程。4.使用酵母双杂交筛选睾丸文库发现GCSE2与SYCE1等多个信号通路蛋白相互作用，暗示着该蛋白通过较为复杂的方式参与精子发生。上述结果表明，GCSE2是一个生殖细胞特异性表达基因，参与精子发生过程。 研究二:小鼠KDM4A基因是一个组蛋白特异性去甲基化酶，广泛表达在小鼠各个组织和发育阶段，然而KDM4A在小鼠生殖和发育过程中的功能仍然是未知的。我们的结果显示:1.通过CRISPR/CAS9直接注射受精卵，可以产生F0代KDM4A突变小鼠，经过连续交配至F2代可以产生KDM4A-/-小鼠。2.KDM4A+、KDM4A+/-和KDM4A-/-母鼠分别和KDM4A+/+公鼠交配，取受精卵体外培养，在囊胚率上没有明显差异。3.KDM4A-/-母鼠与KDM4A-/-公鼠交配，窝产子数量与野生型小鼠之间交配窝产字数没有明显差异。4.检测小鼠体重发现:3周龄和6周龄KDM4A+/+、KDM4A+/-和KDM4A-/-公鼠体重没有明显差异。3周龄和6周龄KDM4A+/+、KDM4A+/-和KDM4A-/-母鼠体重没有明显差异。5.分别对KDM4A+/+和KDM4A-/-小鼠卵巢和睾丸石蜡包埋切片进行HE染色。结果发现KDM4A+/+和KDM4A-/-睾丸和卵巢的组织结构没有明显差异。6.分别分离培养KDM4A+/+和KDM4A-/-6周龄公鼠尾尖成纤维细胞，在第4代绘制细胞增殖曲线。结果发现与KDM4A+/+相比，KDM4A-/-尾尖成纤维细胞具有更好的增殖能力。上述实验结果说明:CRISPR/CAS9基因组编辑系统能够简便高效的制备F0代基因突变小鼠，并且F0代突变小鼠经过杂交，在F2可以获得纯合突变小鼠。KDM4A对小鼠的生殖和发育不是必需的。KDM4A knockout有助于尾尖成纤维细胞体外增殖。 研究三:小鼠睾丸特异性表达基因Spata35的克隆、表达和初步的功能研究。研究结果显示:1.使用生物信息学、RACE、RT-PCR、Real time PCR和Wester nblot证明该基因特异性的表达在小鼠睾丸。2.通过CRISPR/CAS9直接注射受精卵，高效制备F0代Spata35突变小鼠，经过连续交配至F2代产生Deleted89bp Spata35-/-小鼠。4.使用酵母双杂交筛选睾丸文库发现Spata35与PELI1等多个信号通路蛋白相互作用，暗示着该蛋白可能通过较为复杂的方式参与精子发生。上述结果表明，Spata35是一个睾丸特异性表达基因，通过CRISPR/CAS9直接注射受精卵，连续杂交，可以获得Spata35knockout小鼠。