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谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,EC1.11.1.9,简称GPx)是生物机体组织中存在的三种重要的抗氧化酶之一,其主要生物学作用是清除脂质中的过氧化物,有防止畸变、预防衰老及参与前列腺素合成等重要病理生理或生理作用。对肿瘤、心血管疾病、老年性疾病、不孕症等多种疾病有着良好的预防治疗作用,是一种有发展前途潜力的医药用酶和动物饲料添加剂。但该酶稳定性差的特性成为其开发应用的瓶颈难题,为了开拓GPx的应用,对该酶进行化学修饰以提高其物理化学和生物稳定性的研究是关键性的课题。本研究首先检测了GPx在猪体内的动态变化和分布,以确定富含GPx的组织和采集时期,并从猪肺中分离纯化GPx,筛选出GPx的最佳稳定剂和化学修饰剂,优化了GPx的化学修饰条件并对修饰前后GPx酶学性质进行比较,最后进行了修饰产物在模型动物中的初步应用研究,得到以下主要研究结果:
1、对不同品种、性别、日龄及健康状态的猪全血GPx活力进行比较,结果表明:26-150d,长白猪或蓝塘猪GPx活力差异不显著(P＞0.05);蓝塘猪在30d和90d GPx活力显著高于长白猪的活力(P＜0.05),其他日龄活力差异不显著(P＞0.05);杜大长公猪GPx活力显著高于母猪的GPx活力(P＜0.05);健康杜大长猪(公母各半)GPx活力显著高于病猪的GPx活力(P＜0.05)。对不同组织GPx活力和比活力进行比较,结果发现猪的肾、脾、肝、肺、心和回肠等组织的活力和比活力较高。
2、从猪肺中分离纯化GPx,粗酶液经乙醇分步处理,再经DEAE-纤维素(DE52)、DEAE-葡聚糖A50、第二次过DE52处理,最后经葡聚糖G-150处理,获得了产率为1.9％,比活力为3003.74U/mg protein、纯化倍数为718.6倍的GPx纯酶,经SDS-PAGE电泳检验达到了电泳纯,猪肺GPx亚基的相对分子质量为23kD。
3、选择抗氧化剂、高分子化合物等添加剂作为GPx的稳定剂,研究稳定剂种类及其浓度对酶活力的影响,结果表明:葡萄糖、甘油、牛血清白蛋白、亚硒酸钠对GPx没有保护作用;偏重亚硫酸钠会造成酶完全失活;维生素C、半胱氨酸盐酸盐在浓度分别低于20mmol/L,和10mmol/L,时对GPx有保护作用,之后随着浓度的升高,GPx活力会急剧下降;10mmol/LL-半胱氨酸对GPx有一定的保护作用,但存在溶解度低的缺点;二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)及巯基乙醇对GPx有良好的保护作用,三者的最佳使用浓度分别是60mmol/L、60 mmol/L和2 mmol/L。
4、对脂肪酸活性酯、活性聚氧乙烯十二烷基醚(Brij35)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活性酯、活化mPEG1和mPEG2等五种修饰剂进行比较,筛选出活化mPEG1为GPx的最佳修饰剂。为了测定修饰剂的蛋白修饰能力,建立了快速、简便、可靠的检测烷基类修饰剂蛋白修饰能力的方法。对mPEG及活化mPEG1的紫外图谱进行了比较,二者明显不同,利用紫外图谱差异可定性的鉴定终产物mPEG1。
5、通过试验,筛选出mPEG1修饰GPx的最佳反应条件:反应温度15℃,时间45min,pH9.0,反应物配比为1mg GPx加入80mg修饰剂,以GSH作为GPx修饰反应的终止剂,可得到氨基修饰率44.55％,酶活力保持率为104.66％的修饰酶。
6、对修饰前后GPx的酶学性质进行研究,原酶与修饰酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.0;动力学性质表明,原酶与修饰酶均遵循乒乓机制的作用机理;修饰酶表观米氏常数比原酶的高,表明修饰酶对底物的亲和力有所减弱,但修饰酶pH稳定性、耐热性有所增强;修饰酶半衰期明显延长,是原酶的2.37倍;修饰酶抗胰蛋白酶的能力显著增强,经胰蛋白酶处理450min后原酶活力回收为0％,而修饰酶为64.43％。
7、为检测修饰GPx的生物学活性和效果,以D-半乳糖致衰老小鼠为动物模型,通过小鼠腹腔注射给药,研究修饰前后GPx的抗衰老作用,结果表明:修饰前后GPx对小鼠无毒副作用;GPx能显著提高小鼠血清SOD活力和降低肝脏MDA的含量(P＜0.05),mPEG-GPx可显著提高小鼠血清SOD的活力,血清和肝脏GPx活力,降低血清和肝脏.MDA含量(P＜0.05),修饰前后GPx有显著的抗衰老作用,mPEG-GPx抗衰老效果比GPx明显。
综上所述,从廉价易得的猪肺中可分离纯化出GPx纯品,经化学修饰以后,酶的活力和稳定性得到了提高,具备了更好的抗衰老作用,这一研究结果将为GPx今后的开发与应用打下良好的基础。