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神经递质乙酰胆碱通过胆碱能免疫调节系统抑制炎症因子的释放,参与调控机体的免疫反应。课题组前期研究发现,马氏珠母贝血细胞中烟碱型乙酰胆碱受体在插核后有显著性上调,说明胆碱能免疫调节系统参与调控珍珠贝插核后的免疫反应。为了阐明其作用机制,本研究通过分析马氏珠母贝基因组和转录组数据,筛选出胆碱能免疫调节系统的关键基因,并进行基因克隆、表达、细胞定位和表达调控机制分析。主要研究结果如下:(1)乙酰胆碱受体基因的克隆和定量分析:克隆获得马氏珠母贝6个烟碱型乙酰胆碱受体基因(PmnAChRα1、PmnAChRα2、PmnAChRα3、PmnAChRα4、PmnAChRα5和PmnAChRα6)的cDNA全长序列,分别编码465、446、445、420、456和438个氨基酸。6个基因均具有4个典型的跨膜结构域(TM)、半胱氨酸环(Cys~loop)以及保守的胞外段配体结合区域(LBD)。Real-time PCR技术分析显示6个基因在珍珠贝的各个组织中均有分布,鳃中表达量最高;原位杂交表明,6个基因均在不同血细胞中呈现特异性表达,根据血细胞的分类标准,我们推测PmnAChRα1、PmnAChRα2、PmnAChRα3、PmnAChRα4、PmnAChRα5这5个基因则都是在血细胞的大颗粒细胞中呈现出较强的阳性信号。PmnAChRα6基因既在大颗粒细胞中表现出较强的阳性信号,也在小颗粒细胞中检测到其特异性表达。以上研究结果说明马氏珠母贝中存在典型的胆碱能免疫调节系统。(2)胆碱能系统的免疫调控机制分析:马氏珠母贝插核后,6个基因分别在早期(6 h,12 h或者24 h)或晚期(18 d)出现不同程度的上调;在脂多糖LPS刺激后,PmnAChRα1基因的表达水平在12 h处显著上升,其余5个基因均在6h处即出现高表达;胆碱能信号通路下游调控因子NF-kB、IKK和IL-17的表达水平在插核后早期12 h即出现上升;而在LPS刺激后,3个基因也均是在12 h处表达量最高,但是在注射LPS的同时也注释乙酰胆碱受体激活剂Nicotine,NF-kB、IKK和IL-17在12 h的表达量明显被抑制,说明胆碱能系统可以通过调控NF-kB信号通路参与调控机体的免疫反应。(3)胆碱能系统的组织损伤修复机制分析:BMP7、Wnt、Collagen I-α2、Collagen IV-1、Collagen IV-2在插核后18 d出现显著性上调。BMP7和Wnt基因在Nicotine刺激后12 h和24 h处出现高表达,3个胶原蛋白基因Collagen I-α2、Collagen IV-1和Collagen IV-2的表达水平在Nicotine刺激后6 h处显著上升,说明胆碱能系统还可以通过调节BMP7、Wnt和collagen参与调控机体的组织损伤修复。(4)乙酰胆碱受体基因的表达调控分析:基于miRNA与靶基因的调控机制,本研究以课题组前期获得的miRNA转录组数据为基础,通过靶标分析软件RNAhybrid和microTar预测获得miR-873、miR-669m、miR-4577、miR-103a、miR-6753和miR-516b分别作为PmnAChRα1、PmnAChRα2、PmnAChRα3、PmnAChRα4、PmnAChRα5和PmnAChRα6的候选调控miRNAs;双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-873使含有PmnAChRα1基因UTR的载体的荧光素酶活性下调36.2%;miR-669m mimics对PmnAChRα2载体无影响;miR-4577使PmnAChRα3载体的相对荧光素酶活性下调29.6%;miR-103a使PmnAChRα4载体的相对荧光素酶活性下调10.7%;miR-6753使PmnAChRα5载体的相对荧光素酶活性下调27.3%;miR-516b使PmnAChRα6载体的相对荧光素酶活性下调57.3%。本研究为进一步阐述胆碱能免疫调节系统在珍珠贝体内的免疫调控机制奠定基础。