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CollagenⅥ(COLⅥ)是胶原蛋白家族的重要成员，广泛分布于动物体细胞外基质，在脊椎动物骨骼形成过程发挥重要作用。根据本课题组前期建立的马氏珠母贝（双壳纲珍珠贝目珍珠贝科）贝壳基质蛋白数据库，筛选出六个在贝壳含量较高的COLⅥ蛋白。为了探究COLⅥ在马氏珠母贝贝壳形成中的作用，本实验运用聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得COLⅥ基因的cDNA全长，利用荧光定量PCR技术检测基因的表达量分布，并采用原位杂交技术对COLⅥ进行精确定位。通过RNAi技术促使基因表达沉默，探究COLⅥ对贝壳结晶的影响。并利用原核表达技术获得了PmCOLⅥA4-1的重组蛋白。 1.本实验成功克隆得到COLⅥ基因PmCOLⅥA4-1、PmCOLⅥA6-1、PmCOLⅥA6-2的cDNA全长。PmCOLⅥA4-1序列全长3136bp，其中开放阅读框(ORF)长2841bp，编码946个氨基酸，5非翻译区(5 UTR)长93bp，3非翻译区(3UTR)长202bp。PmCOLⅥA6-1序列全长2100bp，其中开放阅读框（ORF）长1875bp，编码624个氨基酸，5非翻译区(5 UTR)长56bp，3非翻译区(3UTR)长169 bp。PmCOLⅥA6-2序列全长2192bp，其中开放阅读框（ORF）长1941bp，编码646个氨基酸，5非翻译区(5 UTR)长41 bp，3非翻译区(3UTR)长210bp。并验证了PmCOLⅥA3、PmCOLⅥA4-2、PmCOLⅥA5基因的编码区。通过序列分析发现六个COLⅥ均缺失Collagen结构域，而vWA结构域较为保守。 2.珍珠囊和外套膜中央区及套膜区是分泌珍珠质的器官，本研究通过荧光定量PCR检测发现PmCOLⅥA3、PmCOLⅥA6-1和PmCOLⅥA6-2在珍珠囊的表达量最高(P＜0.05)，PmCOLⅥA4-1和PmCOLⅥA4-2在外套膜中央区的表达量最高(P＜0.05)，PmCOLⅥA5在珍珠囊和外套膜边缘区都有较高的表达(P＜0.05)。原位杂交实验结果发现PmCOLⅥA4-1、PmCOLⅥA6-1、PmCOLⅥA6-2均定位于马氏珠母贝外套膜中央区和套膜区外侧上皮细胞。表明COLⅥ可能参与马氏珠母贝贝壳珍珠质的形成。 3.合成RNAi探针，对闭壳肌进行注射，分别促使六个COLⅥ基因表达沉默。利用扫描电子显微镜(SEM)观察贝壳内表面结构，发现PmCOLⅥA3、PmCOLⅥA4-1、PmCOLⅥA4-2、PmCOLⅥA5、PmCOLⅥA6-1和PmCOLⅥA6-2基因表达沉默后，贝壳珍珠层内表面超微结构出现不同程度的紊乱，棱柱层结构正常，证明COLⅥ参与马氏珠母贝贝壳珍珠质的形成。 4.本研究构建了pET30a-PmCOLⅥA4-1的原核表达载体，成功地表达PmC OLⅥA4-1蛋白的vWA结构域区域。为了获得大量高纯度重组蛋白，本研究在IPTG浓度为0.5mM，诱导温度为15℃的条件下诱导过夜，对PmCOLⅥA4-1重组蛋白进行扩大培养，通过Ni-IDA亲和层析从包涵体中体中纯化得到3.5mg的PmCOLⅥA4-1融合蛋白。并通过Western blotting检测，鉴定重组蛋白的分子量在20kDa左右，与理论的分子量20.9kDa相一致。 综上所述，PmCOLⅥA3、PmCOLⅥA4-1、PmCOLⅥA4-2、PmCOLⅥA5、PmCOLⅥA6-1和PmCOLⅥA6-2参与马氏珠母贝珍珠质的形成，本研究首次证明了COLⅥ参与软体动物贝壳的矿化，丰富了珍珠层基质蛋白数据库。