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研究背景癫痫是神经系统第二大常见疾病,多为慢性反复发作性病程,部分具有难治性特点,在给患者造成身体心理危害的同时,也给患者的社会功能及家庭、社会带来巨大的损害及负担。人类已经与之搏斗多年,目前对其机制的研究主要集中在神经递质、离子通道、神经胶质细胞、突触联系、遗传及免疫等的异常及神经网络功能异常等学说。尽管我们已经付出很多努力,进行了多方面的探讨及研究,开发了一些新的抗癫痫药物,取得一定临床治疗效果,但仍有很多癫痫患者在现有药物及手段的治疗条件下,仍然反复发作,具有难治性特点。因此,我们仍需要对癫痫的机制不断的进一步开展深入研究,寻找新的治疗切入点,开发新的治疗靶点和药物。近年来的研究发现mTOR和腺苷在癫痫发生、发展及终止中均发挥重要作用,是研究热点。研究发现脑内腺苷在癫痫发作时明显增多,系统或局部应用腺苷或影响腺苷产量的腺苷激酶抑制剂均可有效控制癫痫发作,而腺苷腺苷受体基因敲除鼠可影响癫痫发作,说明腺苷参与了癫痫发病机制。目前已经发现腺苷本身可通过影响递质释放、突触可塑性及离子通道变化、突触后膜稳定性等多方面参与癫痫发病机制,腺苷Al受体在其中介导抗癫痫作用,而A2a受体的激活可能起到反作用,其他受体在其中机制更欠明确。目前,虽然腺苷已经在心内科得到应用,但鉴于大量腺苷在全身性用药时在心血管、呼吸系统等方面的副作用,不能有效应用于癫痫的临床防治,为此人们开发了多种局部增强腺苷的疗法,在脑内局部增强腺苷的释放,而无全身用药时的副作用,此法在基础实验中均取得较好效果,有望成为新的抗癫痫治疗方法。mTOR最早在肿瘤中被发现及研究,随后在结节性硬化患者中发现,其抑制剂雷帕霉素可有效减少结节性硬化患者的癫痫发作频率和程度,从而开启了 mTOR参与癫痫发作机制的研究。目前其抑制剂雷帕霉素也已经应用于结节性硬化等相关疾病的治疗,在发挥免疫抑制作用的同时具有抗癫痫发作作用,而且发现雷帕霉素可以逆转癫痫导致的中枢神经的异常病理改变,证明mTOR在癫痫发病机制中发挥重要作用。mTOR可以通过影响离子通道变化、细胞自噬及炎症等参与癫痫发作机制,下游的p70S6和4E-BP1可控制蛋白的翻译,影响细胞代谢及凋亡。新型mTOR抑制剂依维莫司也已经逐渐应用于临床,较之雷帕霉素具有更好的耐受性和更少的副作用,有望成为某些癫痫新的治疗药物。既往研究中,发现腺苷在肿瘤中可通过PI3K/Akt影响mTOR表达;而mTOR可能也参与了能量代谢,二者在癫痫中的关系无相关研究。本研究通过阅读复习既往文献,发现腺苷参与的能量代谢可导致AMP/ATP比值变化,而这种变化可进一步激活AMPK途径,而AMPK为mTOR上游抑制因子,可有效抑制mTOR的表达,腺苷升高及抑制mTOR的表达均可有效抑制癫痫发作。本研究基于此认为二者在癫痫发作中存在相互关联,腺苷在癫痫发作中可能对mTOR的表达产生影响,二者存在上下游关系,因此,对二者在癫痫发作中的关系进行系统科学实验展开研究探讨。对二者在癫痫发作中的关系进行研究,有利于增强对癫痫发病机制的进一步认识,并将目前繁琐的癫痫发病机制进行有效结合,有利于形成相对简单及系统的癫痫发病机制新认识,开创新的局面。研究目的基于既往研究结果,我们发现腺苷和mTOR之间存在理论上的联系,本研究利用戊四氮诱导的癫痫持续状态的Wistar小鼠模型探讨腺苷在癫痫发作中对mTOR的影响及其之间可能存在的机制,在取得初步结果后,我们对腺苷系统注射后对mTOR影响的时效性进行了初步探讨。研究方法1、在PTZ癫痫模型中腺苷对mTOR表达的影响:取成熟雄性Wistar大鼠(200-220g)为实验对象,分为空白对照组、PTZ诱发癫痫组及ADO实验组,每组8只,空白组以生理盐水/DMSO等溶剂为试剂;癫痫组先注射DMSO,半小时后腹腔内注射PTZ(55-75mg/kg)诱发癫痫持续状态;实验组先注射腺苷,半小时后注射PTZ诱发癫痫持续状态,癫痫发作持续1小时后以10%水合氯醛终止癫痫发作,3小时后取各组海马以western blot分别检测空白对照组、PTZ及ADO干预组大鼠海马的p-mTOR、mTOR、p-S6及β-actin。同时免疫组化进一步检测各组海马CA1区、CA3区p-mTOR进一步验证实验结果。2、腺苷对mTOR影响的机制的探讨:为进一步探讨其中机制,我们设立了空白对照组、ADO组和AMPK抑制剂组,其中AMPK抑制剂组先注射Compound C抑制AMPK的表达,理论上阻断ADO对mTOR影响后,再注射ADO,分别取各组海马,western blot观察海马区磷酸化mTOR的变化。免疫组化进一步检测各组海马CA1区、CA3区p-mTOR进一步验证实验结果。3、腺苷对mTOR影响的时效性:为进一步探讨腹腔注射ADO对mTOR的影响的时效关系,我们进一步分别在ADO注射后60min、120min、180min及360min利用western技术检测大鼠海马p-mTOR的变化。同样,免疫组化进一步检测各组海马CA1区、CA3区p-mTOR进一步验证实验结果。结果1、相关试验药物对大鼠行为学影响:PTZ(55-75mg/kg)可导致急性的癫痫持续状态发作,ADO(200mg/kg)可导致大鼠出现少动、思睡及类似哮喘样发作,在此剂量下,副作用较大。腺苷对PTZ导致的癫痫发作行为的抑制作用本次实验未观察。Wistar大鼠在注射AMPK抑制剂Compound C后出现波浪样肌肉震颤,对PTZ诱导的癫痫持续状态发作极度不耐受,死亡率极高(19/20)。2、在PTZ导致的Wistar大鼠癫痫持续状态的模型中腺苷抑制mTOR的表达:我们发现PTZ组的p-mTOR/mTOR、p-S6/β-actine较空白对照组明显增高(P<0.05),而在PTZ之前注射ADO预处理的ADO组可见p-mTOR/mTOR、p-S6/β-actine比值较PTZ组明显降低(P<0.05)。免疫组化进一步验证了 western blot的结果,CA1 区(对照组:109.9 ± 8.8,PTZ 组:311.7 ± 27.3,ADO+PTZ 组:129.17 ± 10.1)和 CA3 区(对照组,297.2 ± 25.5;PTZ 组,369.5 ± 32.1;ADO+PTZ 组,276.0 ± 23.5)(P<0.05,n = 8)。3、ADO可通过AMPK途径影响mTOR表达:在正常大鼠中,ADO腹腔注射较空白对照组相比,可显著抑制p-mTOR和p-S6的表达(P<0.05);而与提前注射AMPK抑制剂Compound C的实验组相比,该抑制作用被逆转该,p-mTOR和p-S6的表达明显恢复(P<0.05)。免疫组化进一步验证了该结果,海马CA1区(对照组,112.6± 12.6;AD0 组,77.7 ± 9.1;Compound C+AD0 组,104.1 ± 12.0)和 CA3 区(对照组,256.3 ± 21.8;AD0 组,132.5 ± 5.5;Compound C+AD0 组,197.8 ±16.2).(P<0.05,n = 8).4、腺苷对p-mTOR影响的时效关系:在正常大鼠中,腺苷随时间而逐渐抑制mTOR表达,约在3h时抑制作用最明显(P<0.05),此后抑制作用减弱,6小时时基本恢复正常水平。免疫组化进一步验证结果。结论1、腺苷可导致wistar大鼠出现思睡、少动及哮喘发作,有抑制作用;Compound C可引起大鼠肌肉出现波浪样波动,对PTZ导致的癫痫发作极度不耐受。2、在PTZ诱导的wistar大鼠癫痫持续状态中,腺苷可明显抑制p-mTOR及其下游的p-S6表达;3、在正常wistar大鼠中,腺苷可能是通过AMPK途径抑制mTOR磷酸化活化;4、在正常wistsar大鼠中,腺苷在3小时时对mTOR表达的抑制作用最明显;5、在癫痫发作中,腺苷与mTOR通路相互关联,腺苷可能是通过AMPK通路抑制mTOR的磷酸化表达,从而发挥其内源性抗癫痫作用;mTOR通路可能是腺苷调节癫痫发作的重要通路。