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口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)是一种人畜共患的急性，热性，高度接触性的病毒性传染病（陈溥言等2009），主要引起偶蹄类动物发热，四肢、口、舌、鼻和乳房等部位形成水泡和溃烂。口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)基因组为单股正链RNA，可编码12个成熟的病毒蛋白，其中VP0蛋白是病毒的结构蛋白之一，与病毒入侵细胞密切相关。本实验室发现sIFITM3蛋白具有抗病毒效果，为了进一步探索sIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖的机制，本研究利用酵母双杂交、细胞共定位和GST-PullDown技术验证口蹄疫病毒VP0蛋白与sIFITM3蛋白间的相互作用，并通过缺失突变验证sIFITM3蛋白与口蹄疫病毒VP0蛋白相互作用的关键位点及缺失后的sIFITM3蛋白抗口蹄疫病毒功能的变化，通过杆状病毒表达系统表达sIFITM3蛋白和VP2蛋白（VP0蛋白主要亚基），为研究蛋白间的直接相互作用奠定基础，主要研究内容如下: 一、FMDVVP0蛋白与sIFITM3蛋白的相互作用 通过PCR扩增FMDVVP0基因和猪源IFITM3基因氨基端胞外区1-165bp(nsIFITM3)，EcoRI和SalⅠ双酶切后连接入酵母表达载体pGBKT7;EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后将VP0基因和nsIFITM3基因连接入酵母表达载体pGADT7，获得重组质粒pGBKT7-VP0、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0、pGADT7-nsIFITM3。将pGBKT7-VP0和pGADT7-nsIFITM3、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0分别共转化酵母Y2HGold，进行酵母双杂交试验，结果表明VP0蛋白与IFITM3蛋白存在相互作用。 为了进一步验证VP0蛋白与IFITM3蛋白之间的相互作用。采用荧光共定位技术进行研究，结果表明VP0蛋白广泛分布于细胞的胞浆和胞膜中，sIFITM3蛋白分布在细胞的胞膜上，VP0蛋白与sIFITM3蛋白在细胞中均定位在细胞的胞膜。 利用原核表达技术，表达sIFITM3蛋白和VP0蛋白，通过包涵体提取和复性技术，获得目的蛋白，进行GST-PullDown试验，未检测到sIFITM3蛋白和VP0蛋白的相互作用。分析原因，可能因为复性的包涵体蛋白与天然结构存在差异。 免疫共沉淀试验结果表明sIFITM3蛋白和VP0蛋白存在相互作用，为了深入研究sIFITM3蛋白与VP0蛋白相互作用的关键位点，构建了一系列部分缺失的sIFITM3真核表达质粒pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(61-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5和pLenti7.3-IFITM3(1-165)-V5。将上述sIFITM3缺失的质粒分别与pFlag-VP0质粒共转染293T细胞后收集样品进行免疫共沉淀试验，结果表明截短的sIFITM3蛋白与FMDVVP0蛋白均无相互作用。 二、sIFITM3蛋白不同部分缺失后对FMDV病毒增殖的影响 由于不同部分的缺失，导致sIFITM3蛋白无法与FMDVVP0蛋白发生相互作用，为了研究sIFITM3缺失蛋白对抗病毒功能的影响，将重组质粒pLenti7.3-sIFITM3-V5、pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(61-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5、pLenti7.3-eGFP-V5转染BHK细胞后，接种FMDV，进行空斑减少试验，结果表明只有sIFITM3蛋白能够抑制病毒的增殖。 三、构建分别表达sIFITM3和FMDVVP2蛋白的重组杆状病毒 通过在线软件TMHMMServer，v.2.0分析sIFITM3蛋白的结构，找出跨膜区。将sIFITM3基因跨膜区去除，拼接剩余片段，通过基因合成技术获得拼接基因PsIFITM3。扩增PsIFITM3、sIFITM3氨基端1-165bp片段(sIFITM3(1-165))、蜂素信号肽连接氨基端1-165bp片段(FsIFITM3(1-165))、FMDVVP2基因、蜂素信号肽连接VP2基因(FVP2)，HindⅢ和XhoⅠ双酶切后插入到pFBDpH-HA-NA-M1载体中，获得重组质粒pFBD-VP2、pFBD-FVP2、pFBD-PsIFITM3、pFBD-sIFITM3(1-165)和pFBD-FsIFITM3(1-165)。将上述重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑技术筛选，提取阳性重组杆粒，转染Sf9细胞，从而获得重组杆状病毒rBacmid-VP2、rBacmid-FVP2、rBacmid-PsIFITM3、rBacmid-sIFITM3(1-165)和rBacmid-FsIFITM3(1-165)。将上述重组杆状病毒感染Sf9细胞，WesternBlot检测蛋白表达情况，结果表明相应目的蛋白均能够表达。本研究为后续纯化蛋白，进行SPR试验和蛋白结晶试验奠定基础。