【摘 要】
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本文对口服长效促胰岛素激素在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达、检测及其药理学活性进行了分析。本研究通过点突变技术消除了天然GLP-1基因内的DPP-Ⅳ和胰蛋白酶识别位点，rolGLP-
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本文对口服长效促胰岛素激素在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达、检测及其药理学活性进行了分析。本研究通过点突变技术消除了天然GLP-1基因内的DPP-Ⅳ和胰蛋白酶识别位点，rolGLP-1在血液中能够免受DPP-Ⅳ的降解，而且在肠道中也能抵抗胰蛋白酶的酶解，为其口服和注射制剂的研发奠定了良好的基础。在此基础上，通过分子生物学技术将rolGLP-1基因片段多重正向串联重复，将EcoRV和SmaI双酶切获得rolGLP-1基因片段利用同尾酶的特性将其克隆到克隆载体pMDGLP-A上，筛选正向连接的转化子，获得克隆载体pMDGLP-B(2×GLP)，2×GLP表示两个rolGLP-1基因正向串连重复的融合基因，反复多次可以获得不同rolGLP-1拷贝数的融合基因，然后将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9、pPIC9K上，分别获得表达载体pPIC9rolGLP-1、pPIC9KGLP-T(10×GLP)、pPIC9KGLP-U(14×GLP)和pPIC9KGLP-V(18×GLP)。线性化的表达载体通过电脉冲转化法转化毕赤酵母GS115菌株，成功构建了毕赤酵母工程菌株GS115/rolGLP-1、 GS115/10×GLP、 GS115/14×GLP和GS115/18×GLP，GS115/rolGLP-1通过PCR鉴定、其他工程菌株通过Southem dot blotting鉴定表明目的基因已经整合到GS115的基因组DNA上。
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