【摘 要】
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VP3是鸡贫血病毒的功能蛋白,分子量约14 ku,由121个氨基酸组成。由于VP3能够特异性的诱导人肿瘤细胞及转化细胞发生凋亡,而对正常细胞没有凋亡诱导作用,因此又被称为凋亡素,即Apop
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VP3是鸡贫血病毒的功能蛋白,分子量约14 ku,由121个氨基酸组成。由于VP3能够特异性的诱导人肿瘤细胞及转化细胞发生凋亡,而对正常细胞没有凋亡诱导作用,因此又被称为凋亡素,即Apoptin。
大量研究证实:VP3的肿瘤特异性与其在细胞内的定位有关。VP3定位于肿瘤细胞及转化细胞的细胞核内,却定位于正常细胞的细胞质。同时,VP3介导的肿瘤特异性的凋亡途径,不依赖于p53蛋白,也不被抗凋亡分子Bcl-2所抑制。这一显著特点,使得VP3成为近年肿瘤特异性治疗研究的热点。
现有资料显示,VP3在肿瘤细胞和转化细胞中被未知激酶磷酸化。磷酸化的VP3进入细胞核,定位于异染色质和核仁,并与DNA结合形成蛋白-核酸复合物,可能参与抑制基因转录导致细胞的凋亡。同时,VP3还与大量的蛋白质发生相互作用,激活细胞内线粒体凋亡途径,引起肿瘤细胞和转化细胞的凋亡。
但迄今为止,人们对VP3肿瘤特异性的凋亡诱导机制尚未完全阐明。近年研究的焦点多以VP3相互作用蛋白为主,并试图明确VP3作用通路上的各个成员,以揭示VP3特异性诱导凋亡的分子机制。因此,VP3相互作用蛋白的研究具有十分重要的意义。本研究采用PCR方法,从pcDNA-vp3重组质粒DNA中扩增vp3的DNA片段,插入原核表达载体pET-28a(+)构建重组质粒pET-28a(+)-vp3。将该质粒转化工程菌DH5α内进行扩增培养,经序列分析后,再将克隆正确的阳性重组质粒转化入表达菌BL21中,在IPTG诱导下表达6His-VP3融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析,证明含6个组氨酸标签的融合蛋白6His-VP3表达成功。表达产物经Ni-NTA亲和树脂纯化分离,以获得的纯化的6His-VP3融合蛋白为诱饵,利用pull-down技术,捕获其在肿瘤细胞HepG2与正常细胞L-02中相互作用的蛋白。通过SDS-PAGE电泳分析,显示从HepG2细胞和L-02细胞中得到的VP3相互作用蛋白存在差异,这些差异可能正是VP3特异性凋亡效应的关键所在。通过对这些蛋白质的分析鉴定,为揭示VP3的肿瘤特异性的凋亡诱导机制奠定基础。
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