【摘 要】
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以质粒pJLA530为表达载体,耐热性碱性磷酸酯酶在大肠杆菌Mph44中得到表达.超声 破菌后,经PEI沉淀核酸,热变性去杂蛋白,硫酸铵盐析和CM Sepharose Fast Flow柱层析 等纯化步骤
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以质粒pJLA530为表达载体,耐热性碱性磷酸酯酶在大肠杆菌Mph44中得到表达.超声 破菌后,经PEI沉淀核酸,热变性去杂蛋白,硫酸铵盐析和CM Sepharose Fast Flow柱层析 等纯化步骤,得到了纯度在90％左右的酶蛋白.收率约为30％.以戊二醛作交联剂直接把耐热性碱性磷酸酯酶标记到单链DNA上.标记反应的最佳pH在6.5左右,最佳戊二醛浓度为0.25-0.45％,且酶和DNA的用量比应为80:1(重量比).标记到DNA上的酶量与DNA量之比约为20:1.用酶标记的单链DNA作为探针,来检测互补的靶DNA.杂交液在50~68°C时对探针上的酶 活没有明显影响,可进行长达12小时的杂交.在较高温度下进行洗涤,可使杂交的严格性得到控制.用酶底物BCIP/NBT显色后,5pg的互补靶DNA可以检测出来.以λ噬菌体DNA作为异 源DNA作杂交,结果显示0.2微克的异源DNA对结果没有明显的干扰.标记和杂交过程简单方 便,将可能在分子生物学研究及病原体的诊断上得到应用.
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