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病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC))是临床常见的心血管疾病,近年来发病率呈上升趋势。VMC是一种继发于病毒感染后的自身免疫疾病,可演变为扩张型心肌病。病毒性心肌炎还可导致心功能不全和难治性心律失常等,严重影响患者的生命健康,是心源性猝死的常见病因。病毒性心肌炎的发病机制包括病毒的直接损害作用、机体的免疫反应、细胞凋亡、心肌纤维化等。研究表明,T细胞介导的免疫反应在VMC的病情进展中起主要作用,其次是病毒的局部损伤,在VMC及其导致的猝死中,辅助T细胞(Th)和大量细胞因子的异常表达起较关键的作用。Th17细胞是一种新型CD4+T细胞亚群,特异性分泌白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)。 Th17细胞与心血管疾病,尤其是VMC和DCM的发病及病情进展有着密切联系。CCL20(又称巨噬细胞炎性蛋白,MIP-3a)是一种炎性细胞因子,在IL-1β、TNF-α、IFN-γ和LPS(脂多糖)等诱导下,可由内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞分泌,受体是CCR6。CCL20可诱导并趋化白细胞参与炎症反应机制。因此推测在病毒性心肌炎中,Th17细胞是否被CCL20/CCR6募集并浸润心肌组织。本研究拟通过研究CCL20对急性病毒性心肌炎小鼠体内试验和体外试验中Th17细胞的作用阐明Th17细胞在病毒性心肌炎发病机制中的作用。第一部分CCL20对急性病毒性心肌炎小鼠体内试验中Th17细胞的作用研究材料和方法：取96只4周龄雄性BALB/c小鼠,随机分为四组：(1)AVMC组(n=24)：在第0天腹腔接种0.2m1含105PFU CVB3的RPMI-1640(Gibco)培养基和100μl生理盐水,建立CVB3诱导的急性病毒性心肌炎模型；(2)CCL20单抗组(n=24)：在第0天腹腔接种0.2mlCVB3,1小时后再腹腔注射100μg大鼠抗小鼠CCL20单克隆抗体(mAb, R&D);(3)同型对照组(n=24)：在第0天腹腔接种0.2mlCVB3,1小时后腹腔注射100μg小鼠IgG1同型对照抗体(eBioscience);(4)正常组(n-=24)：未做处理。分别于实验的第3天、5天、7天和10天从4组中随机选6只小鼠,取血、心脏,通过Elecsys电化学发光法和Elisa定量检测血清中心肌肌钙蛋白T (cTnT)和CCL20的含量,通过HE染色观察各组小鼠心肌组织的病理变化,利用免疫组织化学观察各组心肌组织中IL-17的表达,流式细胞学技术检测各组小鼠Th17细胞占淋巴细胞的比例。结果：在实验第3天、5天、7天和10天,AVMC组、CCL20mAb组和同型对照组中HW/BW(心脏重量／体重)、病理评分和血清cTnT水平等三个指数均明显高于正常组(p<0.05)。 Elisa定量检测显示,第3天、5天、7天和10天,AVMC组、CCL20mAb组和同型对照组的CCL20水平明显高于正常组(p<0.05); CCL20mAb组的CCL20表达量比AVMC组和同型对照组低(p<0.05)。免疫组化显示心脏内分泌IL-17的细胞在第5天开始出现,第7天最多。AVMC组、CCL20mAb组和同型对照组中分泌IL-17的细胞较正常组明显增加(p<0.05),但CCL20mAb组较另外两组明显减少(p<0.01)。同时流式细胞学检测的AVMC组、CCL20mAb组和同型对照组中在第7天、10天CD4+Th17细胞的比例明显高于正常组(p<0.01); CCL20mAb组较另外两组明显减少(p<0.01)。结论：Thl7细胞和IL-17在急性病毒性心肌炎的发生中有一定的作用,CCL20通过促进Th17细胞的作用而参与急性病毒性心肌炎的发病机制。CCL20mAb通过中和CCL20明显减轻病毒性心肌炎的病理反应。因此,CCL20可成为临床治疗病毒性心肌炎的新的靶点。第二部分CCL20对急性病毒性心肌炎小鼠体外试验中Th17细胞的作用研究材料和方法：取刚出生1-3天的BALB/c小鼠乳鼠,制备原代心肌细胞和心脏成纤维细胞；取出生7天的BALB/c小鼠,分离血管内皮细胞；取AVMC小鼠的脾脏,分离CD4+T细胞。分别在TNF-α、 IFN-γ、 IL-1β IL-6或IL-17等细胞因子刺激下,检测心肌细胞和心脏成纤维细胞中CCL20mRNA和蛋白的表达。同时通过以下实验研究Th17细胞浸润心肌的机制：(1)细胞黏附实验：将心肌内皮细胞接种于24孔Transwell (孔径0.4μm, Corning)小室的上室,将心脏成纤维细胞接种于Transwell下室；2天后将标记的Th17细胞置于Transwell上室,孵育1小时后用PBS洗去未黏附的细胞,在荧光显微镜下计数；并将上室的内皮细胞收集起来通过实时定量PCR检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达；(2)迁移实验：将心脏成纤维细胞接种于24孔Transwell(孔径5μm, Corning)小室的下室,将标记的Th17细胞置于Transwell上室,孵育8小时后在荧光显微镜下计数迁移至下室中的Th17细胞；并且通过流式细胞学检测表达CCR6的细胞数；(3)细胞分化实验：将CD4+T细胞和心脏成纤维细胞在24孔培养板中共培养3天,分别给予抗小鼠CCL20单克隆抗体和同型对照IgGlAb,通过流式细胞学检测分化为Th17细胞的比例。结果：在TNF-α、 IFN-γ、 IL-1β IL-6或IL-17等细胞因子刺激下,心脏成纤维细胞高表达CCL20mRNA和蛋白；而心肌细胞表达CCL20少于成纤维细胞。(1)在TNF-α、TNF-α+CCL20mAb和TNF-α+同型对照组,黏附至内皮细胞的Th17细胞数明显多于生理盐水组(p<0.01); TNF-α+CCL20mAb组少于TNF-α和TNF-α+同型对照组(p<0.01)；含TNF-α的培养体系中,内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平明显升高(p<0.01),而被CCL20mAb中和后,粘附分子的mRNA水平有所下降(p<0.05)。(2)在TNF-α、TNF-α+CCL20mAb和TNF-α+同型对照组,迁移至Transwell下室的Th17细胞数明显高于生理盐水组(p<0.01); TNF-α+CCL20mAb组少于TNF-α和TNF-α+同型对照组(p<0.01)；各组中CCR6的表达没有明显差别；进一步研究发现与CCL20mAb共同培养的Th17细胞迁移至下室的数目远远少于TNF-α和同型对照组(p<0.01)。(3) CD4+T细胞与给予CD3mAb刺激的成纤维细胞共培养后,分化为Th17细胞的比例及分泌IL-17的数目高于单独培养(p<0.05)。结论：在TNF-α等炎症因子作用下分泌CCL20的成纤维细胞可促进Th17细胞黏附至内皮细胞以及迁移至靶组织,从而浸润心肌。但Th17细胞分化与分泌CCL20的成纤维细胞无明显相关性。