α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因挖掘、底物特异性研究与理性设计

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shaodongjia1668
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果胶和木聚糖是存在于自然界中非常丰富的可再生资源,但有时这些资源并没有得到很好地发掘和利用,反而造成了环境污染。有效地转化和利用这类丰富的可再生资源需要多种酶的共同参与,其中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起着非常重要的作用,是本课题的研究重点。它减少阿拉伯糖侧枝产生的空间位阻,使得内切型酶更易结合和分解聚糖主链,从而大大增加水解效率。本研究主要包括以下四个部分:  第一部分,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因挖掘。本章共克隆7个基因,6个检测到活性。来自Ruminococcus albus7的AbfRumal在40℃温浴90小时后仍有35.7%的活力,该酶对底物的Km和Vmax值分别为1.0 mM和270.3μmol·(min·mg)-1。来自Cellulomonasfimi ATCC484的AbfCelf对底物的Km和Vmax值分别为1.5 mM和112.4μmol·(min·mg)-1。  第二部分,AbfCelf的底物特异性研究。本章尝试使用计算机辅助方法分析AbfCelf的底物特异性,将底物特异性实验数据和分子对接计算的结合能进行比对后,发现结合能(⊿G,kcal/mol)以及底物和产物之间的⊿G之差能描述酶反应,并预测反应的可能性。  第三部分,AbfRumal的理性设计。本章使用两种方法对AbfRumal进行温度稳定性的理性改造——基于结构的计算机辅助设计和基于大数据统计的热稳氨基酸替换,证实了两种方法能够不同程度增加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性和温度稳定性。其中,His337突变为Lys后,在50℃的半衰期提高5.3倍,酶活从73.9 U/mg提高到121.5 U/mg,Km和kcat值分别提高到0.8 mM和265.2 s-1,提高了该酶的催化效率。在筛选337位点饱和突变文库时,得到了温度稳定性进一步提高的阳性突变株,H337L和H337I。  第四部分,采用α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和原果胶酶复配提取苹果皮中的果胶,并对果胶性质进行了检测和分析,平均得率为5.35%,水分含量为8.16%,灰分含量为1.82%,粘度为3.67 mPa·S,1%溶液的pH为6.56,酯化度为65.45%,酸法和酶法获得的果胶结构相似。
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