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背景:对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)是临床广泛应用的解热镇痛类非处方药，其过量应用会诱导药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)。目前，临床上对APAP诱导肝损伤的解毒仅限于使用N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)。中药对APAP肝损伤解毒的探索已逐渐成为研究热点，如五味子、乙酰胡椒乙胺等均有报道可以抑制APAP诱导的肝毒性。本课题组前期研究发现中药金银花及其所含的主要化合物绿原酸具有明显的拮抗APAP肝毒性的药效活性。咖啡酸(Caffeic acid，CA)是金银花所含的另一个主要的化合物，和绿原酸一样都属于非黄酮类邻苯二酚化合物，实验室前期研究也发现CA可以抑制APAP诱导的肝细胞毒性，同时其体内动物上拮抗APAP肝毒性的研究也有初步报道，但未阐明其机制，因此CA拮抗APAP肝毒性的机理值得我们进一步深入探讨。 目的:本课题主要从体外细胞、体内动物水平探讨CA拮抗APAP肝毒性的药效活性，并深入研究其抑制APAP肝毒性的分子机理，以及其可能对APAP镇痛药效活性的影响，从而为临床上APAP的解毒及配伍使用提供一定的实验依据，也为CA作为保肝活性创新药物的研究开发奠定基础。 方法: 1.在人正常肝L-02细胞和肝癌HepG2细胞上采用MTT法及ROS的检测研究CA对APAP诱导肝细胞毒性的拮抗作用。 2.通过小鼠体内实验的血清生化指标检测、肝脏病理切片及肝组织GSH、MPO、ROS和MDA的检测进一步验证CA对APAP肝毒性的拮抗作用。 3.通过体外CYP酶活分析实验研究CA对APAP主要代谢酶活性的影响。 4.采用双荧光素酶报告基因法、Western-blot、Real-time PCR、分子对接等实验方法，结合应用抑制剂和siRNA，揭示CA通过调控Nrf2-Keap1信号通路拮抗APAP所致氧应激肝损伤的分子机理。 5.采用双荧光素酶报告基因法、Western-blot、Real-time PCR、ELISA等方法，结合应用ERK1/2抑制剂，揭示CA通过调控ERK1/2-Egr1信号通路拮抗APAP诱导肝损伤的分子机理。 6.采用醋酸扭体法、热板法两个体内动物实验研究CA对APAP镇痛药效活性的影响。 结果: 1.CA显著提高人正常肝L-02细胞和肝癌HepG2细胞上APAP诱导降低的细胞存活率;CA显著减少L-02和HepG2细胞上APAP诱导的ROS产生。 2.在APAP诱导的ICR小鼠肝毒性模型上，CA预防给药具有显著保肝作用:给予APAP(400 mg/kg)4小时后，小鼠血清中ALT和AST水平均显著升高(P＜0.01，P＜0.01);CA(30 mg/kg)能显著降低给予APAP后升高的ALT、AST活力(P＜0.01，P＜0.05); HE染色观察肝组织病理切片发现，CA(10，30 mg/kg)能显著改善APAP诱导的肝组织大范围出血及脂肪样变性;CA能显著逆转APAP改变的肝组织GSH和ROS水平以及MPO活性。在APAP诱导的C57BL/6小鼠肝毒性模型上，CA治疗给药也具有显著改善肝毒性的作用:给予APAP(300mg/kg)1小时后小鼠口服CA(10，30 mg/kg)，能显著降低APAP诱导升高的ALT、AST酶活力(P＜0.001，P＜0.01);病理切片HE染色结果显示，CA(10，30mg/kg)能显著改善APAP诱导的肝组织脂肪样变性及细胞核浓缩;CA(10，30mg/kg)还能显著降低APAP诱导增加的肝组织MDA含量。 3.通过体外CYP酶活分析实验发现CA对APAP主要代谢酶CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4的酶活性没有明显影响。同时CA对APAP的毒性代谢产物NAPQI诱导的肝细胞毒性也具有明显的逆转。 4.在氧应激相关的Keap1-Nrf2信号通路中，CA可以减少Nrf2的抑制蛋白Keap1的表达，同时分子对接实验提示CA可以与Keap1上Nrf2结合位点相互作用，从而阻碍了Keap1与Nrf2的结合。报告基因实验和胞浆胞核蛋白电泳实验证实CA可以诱导Nrf2的转录激活，而应用Nrf2的siRNA可以减弱CA对APAP肝毒性的保护作用。Real-time PCR和蛋白电泳实验均证实CA可以增加Nrf2下游抗氧化酶HO-1，NQO1的基因和蛋白表达，进一步应用HO-1和NQO1抑制剂可以显著降低CA对APAP肝毒性的保护作用。 5.在Egr1信号通路的研究中，发现CA可以降低APAP增加的Egr1基因表达，进一步细胞上报告基因实验和胞浆胞核蛋白电泳实验证实CA可以降低APAP诱导的Egr1转录激活，同时动物组织胞浆胞核蛋白电泳实验也证实CA可以降低APAP诱导的Egr1转核。Real-time PCR，ELISA和蛋白电泳实验发现CA可以降低APAP增加的炎性因子IL-1β、IL-6的表达，降低APAP增加的凝血相关分子Serpine1、TF的表达，同时还可以降低凋亡相关蛋白Gadd45α的表达，这些蛋白都是已知的转录因子Egr1调控的下游信号分子。蛋白电泳实验还发现CA可以抑制APAP诱导的促凋亡蛋白Caspase-3的剪切活化。进一步实验发现CA可以抑制APAP诱导的ERK1/2、JNK的磷酸化激活，应用抑制剂后我们发现ERK1/2抑制剂可以抑制APAP诱导的Egr1转核。 6.通过醋酸扭体法、热板法体内动物实验发现CA对APAP镇痛活性的不具有减效或增效作用，而CA本身有一定的镇痛药效活性。 结论: 1.CA对APAP诱导的体内体外肝毒性都具有拮抗作用，其抑制APAP肝毒性的机制可能是:CA通过降低Keap1蛋白表达，同时抑制Keap1与Nrf2结合，诱导了转录因子Nrf2转录激活，增加了其调控的抗氧化酶HO-1和NQO1的表达，从而抵御APAP诱导的肝氧应激损伤;CA还可以通过抑制APAP诱导的转录因子Egr1的转录激活，从而降低了炎性因子、凝血相关蛋白和凋亡相关信号分子Gadd45α的表达，并抑制了Caspase-3的剪切活化，从而减少了APAP诱导的肝细胞毒性;CA可以抑制NAPQI的肝细胞毒性实验也提示CA抑制APAP的肝毒性并不是通过抑制APAP的代谢。 2.CA对APAP镇痛药效活性没有明显影响，而CA本身则具有明显的镇痛活性，结合CA可以抑制APAP肝毒性的实验，这些研究为CA和APAP配伍使用应用于镇痛提供了一定的实验证据。