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背景与目的：肝癌缺失基因-1(frequently deleted in liver cancer,DLC-1)基因,位于人类染色体8p21.3-22,是一个新的候选抑癌基因,其在人类大多数肿瘤中表达下降或缺失,体内外实验也证实DLC-1基因可抑制多种肿瘤细胞增殖和致瘤性。本课题组前期实验结果显示DLC-1在结直肠癌中发挥抑癌基因作用,通过基因转染技术,将外源性DLC-1cDNA导入DLC-1阴性表达的HT29细胞,抑制结肠癌HT29细胞的增殖和侵袭,引起细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡。DLC-1基因由三个主要结构域SAM(Sterile alpha motif)、RhoGAP(Rho GTPase activating protein)和START(steroidogenic acuteregulatory-related lipid-transfer domains)构成,本实验进一步探究DLC-1基因各结构域在结直肠癌发生发展中的作用及机制。
方法：
1.构建DLC-1基因重组质粒pcDNA3.1-DLC-1以及RhoGAP、SAM、START结构域敲除的pcDNA3.1-ΔRhoGAP-DLC-1、pcDNA3.1-ΔSAM-DLC-1、pcDNA3-1-ΔSTART-DLC-1亚克隆重组质粒。
2.脂质体介导将上述重组质粒分别转染结肠癌HT-29细胞,并通过PCR电泳和测序进行鉴定。
3.MTT、平板克隆实验、Transwell侵袭实验、流式细胞仪技术分别检测细胞生物学行为改变。
4.谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST)Pull-down技术分析RhoA蛋白活性。
5.Western blotting检测p-MLC表达(ROCK激酶活性)。
结果：
1.成功构建pcDNA3.1-DLC-1重组质粒及pcDNA3.1-ΔRhoGAP-DLC-1、pcDNA3.1-ΔSAM-DLC-1、pcDNA3.1-ΔSTART-DLC-1亚克隆重组质粒并转染HT29细胞。
2.MTT实验、平板克隆实验、Transwell侵袭实验及流式细胞术结果显示,pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29亚克隆转染组细胞的增殖能力、侵袭能力及凋亡细胞比例与对照组及空载组相比均无明显差别,而高于DLC-1基因全长转染组。并且,pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29亚克隆转染组细胞的RhoA蛋白活性和ROCK活性较DLC-1基因全长转染组明显增强,与对照组及空载组相比无明显差别。
3.pcDNA3.1-ΔSAM-HT29亚克隆转染相对于DLC-1基因全长转染组更显著的抑制了细胞增殖及RhoA蛋白的活性,增强凋亡,但该组细胞侵袭、ROCK活性与全长转染组相比无明显差异。
4.pcDNA3.1-ΔSTART-HT29亚克隆转染相对于DLC-1基因全长转染组,细胞增殖、侵袭能力增强,凋亡细胞减少,且RhoA蛋白活性、ROCK活性均升高。
结论：
1.DLC-1基因在HT-29细胞中发挥抑癌作用具有RhoGAP依赖性,RhoGAP结构域可能通过抑制RhoA／ROCK通路发挥抑癌基因作用。
2.SAM结构域可能是内源性RhoGAP活性的自身抑制区域,同时,SAM结构域可能通过与其他蛋白、RNA或DNA的相互作用而影响ROCK活性及细胞侵袭。
3.START结构域可能协助RhoGAP结构域而起作用,具体作用途径尚需进一步研究明确。