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目的:肺癌是对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一,具有发病率高,死亡率高和预后差的特点。尽管目前的医学水平对于恶性肿瘤的诊断、治疗有了长足的进步,但肺癌的总体治疗效果仍不容乐观。确切的证据表明广泛侵袭和重要脏器转移是绝大多数肺癌患者的致死原因。目前临床上对于Ⅰ、Ⅱ期未发生转移的患者通常采用手术切除原发灶配合术后放化疗的统一治疗方案。这种治疗方案对转移可能性高低缺乏针对性,给患者带来很大痛苦。因此,能够发现转移早期分子水平上的改变,实现肺癌转移的预警,对于肺癌的个性化治疗具有重要的指导意义。近年来人们已经认识到,肿瘤的发生及其转移是多基因参与的过程。基因水平上的改变能够在肿瘤发生的早期即提示其转移倾向,基因水平上的检测能够发现在组织学水平上可能忽略或无法发现的病理变化。这些基因变化能够及早地预警肿瘤转移可能,进而指导临床治疗方案。基因表达谱芯片为研究肺癌转移相关基因提供了理想的技术支持,通过对转移与否的肿瘤组织基因表达情况的对比分析及相关验证,可以筛选出差异表达的基因群,并了解其变化特征和规律。
肺鳞癌是肺癌中最常见的类型,约占原发性肺癌的50％。本研究应用人类全基因组表达谱芯片,以临床切除的肺鳞癌组织标本作为研究对象,在转录水平上高通量筛选人肺鳞癌转移与非转移肿瘤组织的差异基因,并应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术进行验证。通过对肺鳞癌转移相关差异基因进行初步的筛选与验证,提示潜在的肺鳞癌转移预警标记物,为指导制定更有针对性的个性化的肺鳞癌治疗方案提供有价值的信息。
方法：
1.标本采集与临床病例资料准备
收集大连医科大学附属第一医院和大连市友谊医院胸外科原发性肺鳞癌术中切取的肿瘤组织,离体后立即放入冻存管中于液氮罐暂存,之后放入-80℃深冷冰柜久存。所选病例术前均未行放疗和化疗,且经病理组织学检查明确为原发性肺鳞状细胞癌。通过对病例进行5年以上的连续随访,选取4例转移组与3例非转移组样本进行基因芯片实验,另外选取9例转移组与8例非转移组样本进行实时荧光定量PCR验证实验。
2.全基因组表达谱芯片准备
选用美国Illumina公司生产的人类全基因组表达谱芯片(Human-6Whole-Genome Gene Expression profiling Beadchips)。该芯片为微珠芯片,可同时检测6个样本,每样本分析超过48000个转录本,37000个基因。基因信息来自于美国国立生物技术信息中心(NCBI)的参考序列数据库(RefSeq database,Build36.2,Release22)以及UniGene数据库(UniGene databases,Build199)。
3.RNA抽提,标记与杂交
对进行基因芯片实验的7例样本使用Unizol法抽提肿瘤组织总RNA,通过检测OD值和琼脂糖凝胶电泳验证样品中抽提的总RNA的质量。将上述样品采用美国Ambion公司生产的Ambion Illumina RNA Amplification Kit(cat＃1755)试剂盒逆转录为cDNA,纯化后转录合成cRNA并进行线性扩增。将样本与杂交混合液混合后加入芯片中进行杂交(55℃反应16-22小时),杂交后用清洗缓冲液清洗芯片,用封闭缓冲液封闭芯片,用Streptavidin-Cy3染色,再次清洗芯片后离心甩干待检测。
4.差异基因筛选与结果分析
使用Beadarray500系统对芯片进行扫描,Cubic Spline法进行归一化后生成灰度图,应用BeadStudio sottware(version3.2.7 Illumina Inc.)扫描灰度图后进行差异基因的筛选。筛选标准为:(1)在转移组或非转移组其中任意一组为有效基因(p＜0.01,P值表示荧光信号强度和背景差别的显著性,即在没有特异性探针杂交的情况下检测到某一信号强度的概率)。(2)差异基因在每个转移组样本中的信号值与非转移组所有样本平均信号值的比值,即Ratio值同时满足＞2.0或同时满足＜0.5。对筛选出的差异基因进行聚类分析,了解样本选择情况。应用Genespring GX11(Agilent Technologies)软件进行GO(基因本体论)分析及Pathway分析,分析差异基因参与的生物过程、细胞组分和分子功能。在GO分析中,P(Benjamini-Yekutieli corrected p value)≤0.01具有统计学意义,在Pathway分析中,P(Fishers exact test)≤0.05具有统计学意义。
5.筛选结果的验证
选取另一组样本(转移组样本9例,非转移组样本8例),对差异表达基因中的PDZK1IP1,LCN2,ALDOB及PROM1应用实时荧光定量PCR技术进行相对定量检测与分析。样本肿瘤组织总RNA的抽提和质检方法同上,反转录后,使用Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)试剂盒和AB7900荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)进行RT-qPCR验证。所有反应以内源性管家基因β-aetin作为内参基因。每个待测基因在转移组单个样本的表达与非转移组平均表达进行对比,Fold值算法为2-△△Ct法,其中△△Ct=(Ct特测基因-Ct内参基因)转移组单个-(Ct特测基因-Ct内参基囡)非转移组平均。将RT-qPCR的Fold值和芯片结果的Ratio值分别取以10为底的对数值进行比较,验证两结果是否一致。
结果：
1.RNA质量控制
基因芯片实验样本及RT-qPCR验证实验样本的OD值测定结果显示OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间。每个样本抽提的总RNA含量在50ng～500ng之间。琼脂糖凝胶电泳结果显示28SrRNA和18SrRNA条带清晰,5SrRNA条带略模糊,RNA纯度和完整性较好,样品合格。
2.筛选差异基因
本研究共筛选出肺鳞癌转移相关差异表达基因238个,其中上调基因51个,下调基因187个。部分差异基因与已报道的肿瘤转移相关基因相吻合,部分差异基因未有文献报道。本研究得到的差异基因涉及到细胞间粘附基因,跨膜受体基因,细胞外基质基因,细胞周期基因,细胞生长和增殖基因,凋亡基因,转录因子及调控子基因及其它转移相关基因。
3.差异基因分析
差异基因聚类分析显示肺鳞癌转移组与非转移组组间差异显著,组内样本间具有相似性。GO分析结果显示参与肺鳞癌转移的基因功能团有多种,差异基因主要涉及到细胞外组分、肺泡液体表面张力、免疫细胞增殖和活性的负性调节、腺苷酸环化生物合成和代谢过程、钙离子结合、白介素1的结合、磷酸肌醇介导的信号传导、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性以及丝氨酸水解酶活性等功能集团。Pathway分析显示差异基因中参与肺鳞癌转移的通路主要涉及细胞周期相关通路、Wnt通路、缝隙连接交通和装配通路、结合素到结合质的寡聚反应通路等。
4.部分差异基因验证
所选的4个差异基因在两组实验的肺鳞癌转移组样本中较非转移组样本均呈现表达上调。RT-qPCR验证实验的9例转移组单个样本的Ct值与8例非转移组样本Ct值的均数比较结果显示:差异基因PDZK1IP1及LCN2的9例实时荧光定量PCR结果与芯片检测结果完全一致;差异基因ALDOB的7例与芯片结果一致2例与芯片结果不一致;差异基因PROM1的8例与芯片结果一致,1例与芯片结果不一致。
结论：
1.本实验经过人肺鳞癌标本采集与随访工作,获得了确切的转移与非转移肿瘤组织标本。差异基因聚类分析结果同时显示转移组与非转移组可明确的分为两个组别,说明样本的选择严谨可靠,分组准确,能够为使用芯片进行肺鳞癌转移相关基因的筛选提供可靠的原始资料。
2.人肺鳞癌的转移是一个涉及多基因的复杂过程,众多基因发生表达水平的改变,这些基因参与肿瘤转移的多个功能,多个途径。差异基因主要集中在细胞外组分、肺泡液体表面张力,免疫细胞增殖和活性的负性调节、腺苷酸环化生物合成和代谢过程、丝氨酸型内肽酶等多个功能集团。涉及到的通路包括细胞周期相关通路、Wnt通路、缝隙连接交通和装配通路、结合素到结合质的寡聚反应通路等。
3.实时荧光定量PCR结果与基因芯片结果具有一致性,但不排除芯片结果中假阳性结果。基因芯片能够高通量的筛选出有意义的差异基因,但其结果需要进一步验证。