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肝纤维化过程中肝星状细胞迁移及RhoA作用机制的研究 第一部分 胶原、生长因子（TGF β1、PDGF-BB）对大鼠肝星状细胞迁移及细胞骨架的影响 背景与目的：肝星状细胞（HSC）在肝纤维化的发生发展中起着关键作用，在肝纤维化时，活化的HSC细胞增殖、收缩、分泌细胞因子及细胞外基质成分合成增加，引起Disse间隙微环境的改变。从细胞生物学角度来看，HSC的活化及迁移至少包括细胞增殖变形、细胞内纤维增生，细胞收缩性的获得和通过信号传导释放各种细胞因子等改变。就大多数细胞而言这些环节均与疾病状态下的细胞骨架重排有关。本实验目的在于研究胶原、生长因子（TGF β1、PDGF-BB）对大鼠肝星状细胞迁移及细胞骨架的影响。 方法：分离培养原代大鼠肝星状细胞，用改良的Transwell Chamber观察不同浓度胶原、生长因子（TGF β1、PDGF-BB）直接及趋化刺激后细胞迁移改变，免疫荧光标记肌动蛋白细胞骨架，共聚焦激光扫描显微镜观察生长因子（TGF β1、PDGF-BB）诱导后HSC细胞骨架的变化。 结果： 1．TGF β1、PDGF-BB趋化及直接刺激均可引起HSC细胞迁移增加，与对照组相比，各浓度TGF β1、PDGF-BB刺激后迁移细胞增加差异有显著性意义（P＜0.01）；10μg／ml Ⅰ型胶原趋化及直接刺激后HSC迁移增加不明显，当浓度达到50μg／ml时，其趋化刺激诱导迁移增加与对照组比较差异有显著性（P＜0.05），当浓度达到100μg／ml时，其直接刺激诱导迁移增加与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）；不同浓度Ⅳ型胶原趋化及直接刺激对HSC迁移均无明显影响。 2．激光共聚焦显微镜结果显示，生长因子诱导前大鼠肝星状细胞呈圆形，体积较小，TGF β1、PDGF-BB刺激后细胞呈快速的形态改变：5ng／ml TGF β1刺激5min后可见细胞伸展，丝状伪足形成，15min后可见应力纤维，30min时应力纤维较前增加，并见粘着斑形成；10ng／ml PDGF-BB刺激5min后出现板状伪足，15min时出现应力纤维及粘着斑，少量丝状伪足，30min时应力纤维及丝状伪足较前增加。 结论：Ⅰ型胶原、TGF β1、PDGF-BB均可促进肝星状细胞迁移，而Ⅳ型胶原对HSC迁移无影响；TGF β1、PDGF-BB可诱导HSC细胞骨架的重建。Ⅰ型胶原与生长因子可通过此机制促进肝纤维化发展。第二部分 TGFβ1、PDGF-BB对大鼠肝星状细胞内Rho GTPase信号通路的影响 背景与目的：Rho家族小G蛋白是细胞骨架肌动蛋白的重要调节因子，目前众多的研究集中在Rho家族成员中的Cdc42、Rac1和RhoA上。在细胞极化、细胞表型转化及迁移过程中，Rho家族GTP酶是联系细胞外信号与肌动蛋白细胞骨架系统的关键因子。我们已证实TGFβ1、PDGF-BB可诱导HSC细胞骨架改变及促进细胞迁移，现进一步研究在此过程中Rho GTP酶的表达，初步推断其在HSC细胞迁移中的信号传导机制。 方法：用实时荧光定量PCR、Western blot及GST pull down方法检测不同浓度TGFβ1及PDGF-BB刺激后大鼠HSC内RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA、总蛋白及活性蛋白表达的变化。 结果： 1．实时荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，TGFβ1刺激后RhoA mRNA表达增加，并呈一定的浓度依赖性；而Rac1、Cdc42 mRNA表达无明显变化；各浓度PDGF-BB刺激后大鼠肝星状细胞RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表达无明显差异。 2．Western blot检测结果显示，不同浓度TGFβ1、PDGF-BB对大鼠肝星状细胞内RhoA总蛋白表达均无明显影响。 3．GST pull down结果显示：与对照组相比，TGFβ1刺激后活性的Cdc42、RhoA蛋白增加而活性Rac1蛋白的表达无明显改变；不同浓度PDGF-BB刺激大鼠HSC后，活性Cdc42、Rac1、RhoA蛋白均增加，三种活性蛋白表达均在PDGF-BB浓度达到10ng/ml时达到最高值，再增加浓度蛋白表达不随之升高。 结论：TGFβ1调节大鼠HSC肌动蛋白骨架系统可能主要通过Cdc42、RhoA蛋白而非Rac1蛋白，而PDGF-BB则可能通过Cdc42、Rac1、RhoA蛋白的作用。提示Rho GTP酶可能为HSC活化及迁移的细胞生物学基础。 第三部分 RhoA在大鼠HSC迁移及细胞骨架构建中的作用 目的：观察RhoA突变对HSC迁移及细胞骨架改变的影响及PDGF-BB、TGFβ1的干预作用，为肝纤维化的基因治疗寻求新的途径。 方法：将含RhoA突变基因的质粒转染大鼠HSC构建野生型、活化突变型及显性负突变型RhoA肝星状细胞，Western blot检测转染后各组细胞RhoA表达。用改良的Transwell Chamber观察Ⅰ型胶原、生长因子（TGFβ1、PDGF-BB）直接及趋化刺激后转染细胞迁移改变，免疫荧光标记肌动蛋白细胞骨架，共聚焦激光扫描显微镜观察TGFβ1、PDGF-BB诱导后细胞骨架的变化。 结果： 1．Western blot检测显示与未转染的HSC相比，转染活化突变型、野生型RhoA的HSC中RhoA蛋白表达明显增加，转染显性负突变型RhoA的HSC中RhoA蛋白表达明显减少。 2．野生型RhoA转染细胞组生长因子刺激后应力纤维及伪足形成与未转染组相似；PDGF-BB、TGFβ1刺激后活化突变型RhoA转染的HSC可见应力纤维随时间延长而明显增加、增粗，细胞周围粘着斑形成增加，而丝状伪足及板状伪足形成无明显变化；与此相反，显性负突变型RhoA转染HSC在刺激后未见应力纤维及粘着斑的出现。 3．与对照组相比，持续活化突变型及显性负突变型RhoA转染的HSC细胞迁移均减少。但Ⅰ型胶原、生长因子（TGFβ1、PDGF-BB）直接及趋化刺激后细胞迁移仍有增加。 结论：RhoA参与了TGFβ1、PDGF-BB诱导后HSC肌动蛋白骨架系统的重排，为生长因子、胶原诱导大鼠HSC迁移的信号传导途径之一。