【摘 要】
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根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)Rice株基因序列,在gE基因编码区上下游设计一对引物,以PrV闽A株(Min-A)为模板进行PCR扩增,得到与靶基因一致的约1.77Kb的片段.将该产物克隆到p
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根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)Rice株基因序列,在gE基因编码区上下游设计一对引物,以PrV闽A株(Min-A)为模板进行PCR扩增,得到与靶基因一致的约1.77Kb的片段.将该产物克隆到pUC119载体上,得到重组质粒pRZE;将pRZE以BamHI/EcoRI双酶切片,回收目的片段亚克隆于杆状病毒载体pVL1392中,获得重组转移载体pVLE.将pVLE与杆状病毒线性DNA共转染Sf9昆虫细胞,经三轮蚀斑筛选,获得重组杆状病毒rBVE.对经重组杆状病毒rBVE感染的Sf9细胞进行PrV间接免疫荧光试验,可在细胞膜上见到特异的绿色荧光.将重组病毒感染的细胞裂解、变性后进行SDS-PAGE电泳,染色后可见重组病毒感染的细胞明显有一条多于正常细胞的带;电泳后将蛋白带转移至硝酸纤维素膜上,Western-blot分析可见重组病毒感染的细胞随时间的变化合成了84.1ku-93.1ku的蛋白带;经Dot-ELISA证实表达产物与伪狂犬病阳性血清有特异的结合能力.利用rBVE昆虫细胞表达产物建立了gE-ELISA伪狂犬病强弱毒鉴别诊断方法,确定其最适抗原包被量为1~2μg/孔;封闭液选用含1﹪的马血清的PBS(pH7.4,0.01mol/L);被检血清稀释度选择1:50~1:100,作用时间为60分钟.根据对经中和试验鉴定为伪狂犬病阴性的49份SPF猪血清或现地血清的检测结果的统计学分析,确定gE-ELISA判定标准为:被检血清P/N≥1.98判为阳性,P/N值≤1.98判为阴性.交叉实验证实,gE-ELISA方法对猪其他8种疫病阳性血清及SPF猪血清无交叉反应;竞争性抑制实验表明重组表达的gE可与抗gE抗体发生特异性的结合反应;批内、批间重复性实验说明该方法重复性良好;动物实验验证了该方法有较强的敏感性,可检出攻毒后14天到至少87天的血清抗体.5份实验室感染伪狂犬病野毒的猪血清gE-ELISA检测为阳性,4份实验室基因缺失疫苗免疫猪血清该方法为阴性,而病毒中和试验与全病毒ELISA为阳性,证实gE-ELISA可以有效鉴别强弱毒感染.此外,通过对现地样品的检测,以及与国外竞争单抗ELISA试剂盒的对比实验,证明所建立的gE-ELISA伪狂犬病强弱毒鉴别诊断方法特异性强、敏感性高、重复性好.此鉴别诊断方法将进一步扑灭猪伪狂犬病计划中发挥重要作用.
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