论文部分内容阅读
目的：临床上观察早期静脉输注丙氨酰谷氨酰胺是否对重症急性胰腺炎患者肠屏障功能有保护作用。同时通过SD大鼠急性出血坏死性胰腺炎动物模型分析肠黏膜屏障功能障碍的发生机制。探讨丙氨酰谷氨酰胺对急性出血坏死性胰腺炎动物模型肠黏膜屏障的保护作用和保护机理。
方法：
第一部分2015年1月至2016年12月本院收治的重症急性胰腺炎患者80例为研究对象，根据是否静脉补充丙氨酰谷氨酰胺随机分为对照组与观察组，分别在治疗后1d、3d、7d和10d观察血清学指标变化。利用相关试剂盒检测两组患者血清中的D-乳酸、内毒素以及炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。观察两组间肠功能恢复时间、重症监护入住时间和呼吸机使用率。
第二部分利用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射构建SD大鼠急性出血坏死性胰腺炎动物模型。36只SD大鼠随机分为对照组和模型组，每组18只，分别在造模后6h、12h和24h处死大鼠。碘比色法检测大鼠血清中淀粉酶含量。从大体形态和光镜病理判断模型，同时HE染色观察模型中回肠组织肠上皮损伤变化，扫描电镜下观察肠上皮微绒毛和细胞间隙的变化。检测造模后不同时间点大鼠血清中二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平变化。ELISA法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α变化。荧光定量RT-PCR检测回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κBmRNA的表达水平变化。WesternBlotting检测回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1蛋白表达含量。凝胶电泳迁移法检测回肠组织中核因子-κB的DNA结合活性。免疫组化观察回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κB的表达情况。
第三部分将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、治疗A组—低剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.2g/kg)、治疗B组—中剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.4g/kg)和治疗C组—高剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.8g/kg)。造模24h后对照组给予尾静脉注射静脉用水1ml，治疗A组以0.2g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，治疗B组以0.4g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，治疗C组以0.8g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，每天一次。分别在治疗后1d、3d、5d和7d检测血清学指标。观察大鼠模型死亡率，检测血清淀粉酶、二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素及血清促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平变化，HE染色和扫描电镜观察大鼠回肠组织肠上皮改变。荧光定量RT-PCR检测回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κBmRNA的表达水平变化。WesternBlotting检测回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1蛋白表达含量。凝胶电泳迁移法检测回肠组织中核因子-κB的DNA结合活性。免疫组化观察回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κB的表达情况。
结果：
第一部分观察组入住重症监护时间(5.8±0.4天)明显低于对照组(8.6±0.6天)(P＜0.05)。观察组肠功能恢复时间(4.2±0.2天)早于对照组(5.4±0.5天)(P＜0.05)。对照组共有18例应用有创呼吸机，而观察组为12例，二者之间具有差异性(P＜0.05)；而观察组呼吸机平均使用时间(5.2±0.3)天明显短于对照组(7.5±0.4天)(P＜0.05)。丙氨酰谷氨酰胺对于重症急性胰腺炎患者血清中D-乳酸、内毒素水平、IL-1β、IL-6和TNF-α在治疗前和治疗后1天无明显差异(P＞0.05)，而在治疗3天、7天和10天时，观察组的D-乳酸、内毒素水平和IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明显得到改善(P＜0.05)。
第二部分成功构建SD大鼠急性出血坏死性胰腺炎动物模型，在造模后6h出现胰腺坏死，淀粉酶升高，在24h胰腺坏死最重。在模型组观察到造模后6h回肠绒毛无明显改变，在24h发现绒毛变短，长短不一。扫描电镜下发现造模后6h发现回肠组织微绒毛变短和细胞间隙增大。发现造模后6h二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素开始上升，且在造模后24h为高峰。细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在造模后6h高于对照组(P＜0.05)，且在24h为最高。造模6h发现回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达下降，而且其蛋白水平也发现减低，免疫组化回肠组织中发现二者的表达减弱，在造模后24h最为显著。核因子-κBmRNA在造模后6h发现表达出现增强，其DNA结合活性增加，免疫组化发现其表达增强，且向核内移位，在造模后24小时最为显著。
第三部分治疗前各组SD大鼠分别为对照组12只、模型组10只、治疗A组9只、治疗B组10只、治疗C组10只，7天后各组SD大鼠分别为对照组12只、模型组6只、治疗A组8只、治疗B组10只、治疗C组8只，死亡率分别为0%、40.0%、11.1%、0和20.0%。治疗前4组动物模型淀粉酶含量没有显著差异(P＞0.05)，治疗7天后治疗A组与治疗B组已经与对照组相比没有明显差异(P＞0.05)。治疗前和治疗1天动物模型各组二胺氧化酶、内毒素、D-乳酸和血清促炎细胞因子含量没有显著差异(P＞0.05)，而在治疗3天、5天以及治疗7天时，各治疗组中二胺氧化酶、内毒素、D-乳酸和IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明显得到改善，且以治疗B组最为显著。回肠组织病理提示各治疗组肠上皮受损程度明显减轻，扫描电镜下观察可见微绒毛结构恢复，细胞间隙恢复正常，且以治疗B组改善最为明显。进一步研究结果发现，与对照组相比，模型组回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达下降，而且其蛋白水平也发现同步减低，免疫组化回肠组织中发现二者的表达减弱。模型组回肠组织中核因子-κBmRNA发表达出现增强，其DNA结合活性增加，免疫组化发现其表达增强，且向核内移位。而治疗各组回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达增强，而且其蛋白水平增加，免疫组化回肠组织中表达水平增加，其中以治疗B组最佳。各治疗组回肠组织中核因子-κBmRNA表达下降，其DNA结合活性降低，回肠组织中蛋白表达水平下降，其中以治疗B组最佳。
结论：
1.丙氨酰谷氨酰胺可减低重症急性胰腺炎患者血清内毒素和D-乳酸水平，改善肠屏障功能,促进肠功能的恢复。
2.丙氨酰谷氨酰胺可改善患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的水平，缩短重症监护时间。
3.急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠动物模型中早期即出现肠屏障功能受损，核因子-κB上调和活化，通过其介导的促炎细胞因子参与了其肠黏膜损伤的发生发展。
4.Occudin蛋白和紧密连接蛋白-1的下调和表达下降在急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠动物模型肠黏膜损伤中发挥着重要作用。
5.早期静脉给予丙氨酰谷氨酰胺可以改善急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠肠屏障功能，而以0.4g/kg为佳。
6.丙氨酰谷氨酰胺可上调肠上皮中ZO-1和Occludin表达，促进其机械屏障的恢复，减少内毒素水平。
7.丙氨酰谷氨酰胺可通过减少和抑制核因子-κB表达和活化，进而抑制其介导的促炎细胞因子的表达，从而改善急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠肠屏障功能。
方法：
第一部分2015年1月至2016年12月本院收治的重症急性胰腺炎患者80例为研究对象，根据是否静脉补充丙氨酰谷氨酰胺随机分为对照组与观察组，分别在治疗后1d、3d、7d和10d观察血清学指标变化。利用相关试剂盒检测两组患者血清中的D-乳酸、内毒素以及炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。观察两组间肠功能恢复时间、重症监护入住时间和呼吸机使用率。
第二部分利用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射构建SD大鼠急性出血坏死性胰腺炎动物模型。36只SD大鼠随机分为对照组和模型组，每组18只，分别在造模后6h、12h和24h处死大鼠。碘比色法检测大鼠血清中淀粉酶含量。从大体形态和光镜病理判断模型，同时HE染色观察模型中回肠组织肠上皮损伤变化，扫描电镜下观察肠上皮微绒毛和细胞间隙的变化。检测造模后不同时间点大鼠血清中二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平变化。ELISA法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α变化。荧光定量RT-PCR检测回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κBmRNA的表达水平变化。WesternBlotting检测回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1蛋白表达含量。凝胶电泳迁移法检测回肠组织中核因子-κB的DNA结合活性。免疫组化观察回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κB的表达情况。
第三部分将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、治疗A组—低剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.2g/kg)、治疗B组—中剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.4g/kg)和治疗C组—高剂量丙氨酰谷氨酰胺组(0.8g/kg)。造模24h后对照组给予尾静脉注射静脉用水1ml，治疗A组以0.2g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，治疗B组以0.4g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，治疗C组以0.8g/kg丙氨酰谷氨酰胺的用量给予尾静脉注射1ml溶液总量，每天一次。分别在治疗后1d、3d、5d和7d检测血清学指标。观察大鼠模型死亡率，检测血清淀粉酶、二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素及血清促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平变化，HE染色和扫描电镜观察大鼠回肠组织肠上皮改变。荧光定量RT-PCR检测回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κBmRNA的表达水平变化。WesternBlotting检测回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1蛋白表达含量。凝胶电泳迁移法检测回肠组织中核因子-κB的DNA结合活性。免疫组化观察回肠组织中咬合蛋白、紧密连接蛋白-1和核因子-κB的表达情况。
结果：
第一部分观察组入住重症监护时间(5.8±0.4天)明显低于对照组(8.6±0.6天)(P＜0.05)。观察组肠功能恢复时间(4.2±0.2天)早于对照组(5.4±0.5天)(P＜0.05)。对照组共有18例应用有创呼吸机，而观察组为12例，二者之间具有差异性(P＜0.05)；而观察组呼吸机平均使用时间(5.2±0.3)天明显短于对照组(7.5±0.4天)(P＜0.05)。丙氨酰谷氨酰胺对于重症急性胰腺炎患者血清中D-乳酸、内毒素水平、IL-1β、IL-6和TNF-α在治疗前和治疗后1天无明显差异(P＞0.05)，而在治疗3天、7天和10天时，观察组的D-乳酸、内毒素水平和IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明显得到改善(P＜0.05)。
第二部分成功构建SD大鼠急性出血坏死性胰腺炎动物模型，在造模后6h出现胰腺坏死，淀粉酶升高，在24h胰腺坏死最重。在模型组观察到造模后6h回肠绒毛无明显改变，在24h发现绒毛变短，长短不一。扫描电镜下发现造模后6h发现回肠组织微绒毛变短和细胞间隙增大。发现造模后6h二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素开始上升，且在造模后24h为高峰。细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在造模后6h高于对照组(P＜0.05)，且在24h为最高。造模6h发现回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达下降，而且其蛋白水平也发现减低，免疫组化回肠组织中发现二者的表达减弱，在造模后24h最为显著。核因子-κBmRNA在造模后6h发现表达出现增强，其DNA结合活性增加，免疫组化发现其表达增强，且向核内移位，在造模后24小时最为显著。
第三部分治疗前各组SD大鼠分别为对照组12只、模型组10只、治疗A组9只、治疗B组10只、治疗C组10只，7天后各组SD大鼠分别为对照组12只、模型组6只、治疗A组8只、治疗B组10只、治疗C组8只，死亡率分别为0%、40.0%、11.1%、0和20.0%。治疗前4组动物模型淀粉酶含量没有显著差异(P＞0.05)，治疗7天后治疗A组与治疗B组已经与对照组相比没有明显差异(P＞0.05)。治疗前和治疗1天动物模型各组二胺氧化酶、内毒素、D-乳酸和血清促炎细胞因子含量没有显著差异(P＞0.05)，而在治疗3天、5天以及治疗7天时，各治疗组中二胺氧化酶、内毒素、D-乳酸和IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明显得到改善，且以治疗B组最为显著。回肠组织病理提示各治疗组肠上皮受损程度明显减轻，扫描电镜下观察可见微绒毛结构恢复，细胞间隙恢复正常，且以治疗B组改善最为明显。进一步研究结果发现，与对照组相比，模型组回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达下降，而且其蛋白水平也发现同步减低，免疫组化回肠组织中发现二者的表达减弱。模型组回肠组织中核因子-κBmRNA发表达出现增强，其DNA结合活性增加，免疫组化发现其表达增强，且向核内移位。而治疗各组回肠组织中咬合蛋白和紧密连接蛋白-1mRNA表达增强，而且其蛋白水平增加，免疫组化回肠组织中表达水平增加，其中以治疗B组最佳。各治疗组回肠组织中核因子-κBmRNA表达下降，其DNA结合活性降低，回肠组织中蛋白表达水平下降，其中以治疗B组最佳。
结论：
1.丙氨酰谷氨酰胺可减低重症急性胰腺炎患者血清内毒素和D-乳酸水平，改善肠屏障功能,促进肠功能的恢复。
2.丙氨酰谷氨酰胺可改善患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的水平，缩短重症监护时间。
3.急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠动物模型中早期即出现肠屏障功能受损，核因子-κB上调和活化，通过其介导的促炎细胞因子参与了其肠黏膜损伤的发生发展。
4.Occudin蛋白和紧密连接蛋白-1的下调和表达下降在急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠动物模型肠黏膜损伤中发挥着重要作用。
5.早期静脉给予丙氨酰谷氨酰胺可以改善急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠肠屏障功能，而以0.4g/kg为佳。
6.丙氨酰谷氨酰胺可上调肠上皮中ZO-1和Occludin表达，促进其机械屏障的恢复，减少内毒素水平。
7.丙氨酰谷氨酰胺可通过减少和抑制核因子-κB表达和活化，进而抑制其介导的促炎细胞因子的表达，从而改善急性出血坏死性胰腺炎SD大鼠肠屏障功能。