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研究背景和目的
结直肠癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均位居第三位，其术后复发转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因之一。在临床研究中发现，在复发转移的患者中约有30%出现肠道复发。肿瘤的肠道复发不仅取决于肿瘤细胞自身的生物学特征，还与大量免疫细胞、基质细胞及炎症因子所形成的微环境密切相关。在肺转移模型、胰腺癌肝转移模型中，中性粒细胞、库普弗细胞在肺部浸润形成免疫抑制微环境，促进肿瘤的转移。研究表明肿瘤在发生转移之前，转移灶已营造了一种免疫抑制性微环境，以协助肿瘤转移。但对于结直肠癌患者在发生肠道局部复发之前，复发部位是否形成免疫抑制微环境还不是很清楚。因此在本研究中，我们以癌旁肠道组织代表残余肠道的状态，探讨肠道组织中的免疫微环境对结直肠癌患者肿瘤局部侵袭、复发的影响。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)是肿瘤微环境中数量最多、功能最强的免疫细胞之一。TAMs主要是由肿瘤微环境中分泌的趋化因子通过招募外周血中的单核细胞到组织中并在微环境中炎症因子的作用下进一步分化而来。巨噬细胞在不同的炎症因子的作用下可以分化成不同的亚型。Th1细胞因子可激活巨噬细胞并使其向M1型巨噬细胞分化。Th2细胞因子可将巨噬细胞分化成M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，发挥抵抗肿瘤进展的功能；M2型巨噬细胞主要分泌抑炎因子，促进肿瘤的进展。目前认为TAMs的功能更偏向于具有促癌作用的M2型巨噬细胞，因此M2型巨噬细胞通常被认为是TAMs的表型。CD163、CD206为巨噬细胞表面受体，是TAMs相对特异的标志物。TAMs的浸润与多种肿瘤，包括淋巴瘤、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌的恶性程度及不良预后密切相关，即TAMs浸润数目越多，提示患者处于越晚期的状态，预后越差。目前研究者们逐渐开始关注巨噬细胞在肿瘤转移中的作用。在远端转移模型中，TAMs在肿瘤远端肺、肝转移前微环境的形成中起着关键作用。然而，TAMs在局部癌旁肠道组织中的浸润情况以及功能尚不清楚。
本研究中，在第一部分，我们分别在基因水平、蛋白水平检测了TAMs在结直肠癌患者组织中的分布情况，明确TAMs在癌旁组织中浸润较多，并进一步分析其功能以及与临床参数、患者预后之间的关系，发现TAMs在癌旁组织中分泌抑炎因子较多，且其浸润数目越多，患者分期越晚，预后越差。其次，在第二部分中，我们进一步探究TAMs在癌旁组织中浸润的机制，首先通过筛选与单核细胞招募相关的趋化因子发现CXCL12在癌旁组织中分泌水平较高，同时发现CXCL12主要来源于成纤维细胞。通过阻断CXCL12、CXCR4，进一步明确了CXCL12/CXCR4信号通路在成纤维细胞促进TAMs累积过程中的作用。我们进一步探究了CXCL12促进单核细胞极化的机制，发现CXCL12主要通过与CXCR4结合后激活下游MAPK/ERK信号通路促进单核细胞分化。本部分阐明了癌旁组织中TAMs的浸润主要通过CXCL12/CXCR4/MAPK/ERK信号通路。然后，在第三部分中，我们构建了原位成瘤模型，明确了靶向CXCR4可以逆转TAMs在癌旁部位的累积及其对肿瘤侵袭的影响。最后，在第四部分中，我们通过临床样本检测CXCL12、CXCR4信号通路分子的表达与TAMs、肿瘤侵袭转移分子的相关性及其与临床参数的关系。本研究阐明了TAMs在结直肠癌旁组织的浸润情况及其浸润机制，揭示了结直肠癌患者术后肠道复发的原因，为结直肠癌患者的治疗提供新的靶点。
第一部分TAMs在结直肠癌患者组织中的表达及临床意义
研究方法
1)荧光定量PCR、流式细胞分析技术检测结直肠癌患者癌组织、癌旁组织及正常肠道组织中TAMs的表达水平及功能。
2)免疫组化方法检测结直肠癌患者组织中CD163的表达水平。
3)免疫荧光实验检测CD14与CD163的共定位情况。
4)磁珠分选及流式细胞仪分选结直肠癌组织及癌旁组织中的TAMs。
5)多因子检测分析结直肠癌组织及癌旁组织中TAMs的炎症因子的分泌水平。
6)利用TCGA及GEO数据库验证TAMs在结直肠癌组织及癌旁组织的表达水平。
研究结果
1)TAMs在结直肠癌旁组织中高表达。
2)结直肠癌旁组织中TAMs的浸润越多，患者分期越晚，预后越差。
3)结直肠癌旁组织TAMs分泌抑炎因子较多，发挥促肿瘤功能。
第二部分TAMs在结直肠癌旁组织中累积的机制
研究方法
1)荧光定量PCR方法检测结直肠癌组织及癌旁组织、正常肠道组织中趋化因子的表达及体外极化实验中M1、M2相关标志物的水平。
2)ELISA方法检测组织上清中CXCL12的分泌水平。
3)磁珠分选方法从健康人外周血单个核细胞中分离纯化出单核细胞。
4)Transwell方法检测CXCL12及成纤维细胞上清对单核细胞的趋化能力。
5)流式细胞分析技术检测趋化因子受体在结直肠癌患者外周血单核细胞上的表达情况及单核细胞向M2极化的比例。
6)免疫荧光共定位方法检测CXCL12的主要来源。
7)Westernblotting方法检测CXCL12对单核细胞极化相关信号通路的影响。
研究结果
1)CXCL12在结直肠癌旁组织中高表达并与TAMs呈正相关。
2)CXCL12主要来源于成纤维细胞。
3)结直肠癌旁组织中TAMs的累积主要通过CXCL12/CXCR4/MAPK/ERK信号通路促进单核细胞的招募与极化。
第三部分动物实验验证CXCL12/CXCR4通路在结直肠癌旁TAMs累积中的作用
研究方法
1)构建Balb/C裸鼠及野生型小鼠原位成瘤模型。
2)构建Luc-GFP-HCT116、Luc-GFP-CT26细胞系。
3)磁珠分选及流式细胞仪分选健康人外周血中的CXCR4+CD14+和CXCR4-CD14+两群细胞。
4)流式及荧光定量PCR方法检测TAMs在原位成瘤小鼠组织中的累积情况。
5)小动物活体成像系统观察小鼠原位肿瘤及肠道侵袭肿瘤的荧光强度。
6)免疫荧光实验检测TAMs及肿瘤细胞在组织中的浸润情况。
研究结果
1)CXCR4+CD14+单核细胞更易向结直肠癌旁组织累积并促进肿瘤向肠道部位的侵袭。
2)靶向CXCR4抑制TAMs在癌旁组织的累积并阻止肿瘤进展。
第四部分临床标本验证CXCL12、CXCR4的表达与TAMs的关系
研究方法
1)免疫组化方法检测结直肠癌患者组织中CXCL12、CXCR4在蛋白水平上的表达情况。
2)利用TCGA数据库验证CXCL12、CXCR4在癌旁组织的表达水平，并分析与TAMs相关标志物和肿瘤侵袭转移相关基因之间的相关性。
研究结果
1)CXCL12、CXCR4在结直肠癌旁组织的表达与TAMs密切相关。
2)CXCL12、CXCR4与患者不良预后相关的临床参数有关联。
3)CXCL12、CXCR4及TAMs与肿瘤侵袭转移相关标志物呈正相关。
结论
1)TAMs在结直肠癌旁组织中高表达且与患者不良预后相关。
2)TAMs在结直肠癌旁组织中高分泌抑炎促癌因子，发挥促肿瘤作用。
3)TAMs在结直肠癌旁组织中的累积主要通过成纤维细胞分泌CXCL12与单核细胞表面CXCR4结合激活下游MAPK/ERK信号通路促进单核细胞的招募与极化。
4)靶向CXCR4逆转TAMs在结直肠癌旁部位的聚集及对肿瘤侵袭的影响。
5)结直肠癌旁组织中CXCL12、CXCR4信号通路分子及TAMs的浸润与肿瘤的侵袭转移密切相关。
结直肠癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均位居第三位，其术后复发转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因之一。在临床研究中发现，在复发转移的患者中约有30%出现肠道复发。肿瘤的肠道复发不仅取决于肿瘤细胞自身的生物学特征，还与大量免疫细胞、基质细胞及炎症因子所形成的微环境密切相关。在肺转移模型、胰腺癌肝转移模型中，中性粒细胞、库普弗细胞在肺部浸润形成免疫抑制微环境，促进肿瘤的转移。研究表明肿瘤在发生转移之前，转移灶已营造了一种免疫抑制性微环境，以协助肿瘤转移。但对于结直肠癌患者在发生肠道局部复发之前，复发部位是否形成免疫抑制微环境还不是很清楚。因此在本研究中，我们以癌旁肠道组织代表残余肠道的状态，探讨肠道组织中的免疫微环境对结直肠癌患者肿瘤局部侵袭、复发的影响。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)是肿瘤微环境中数量最多、功能最强的免疫细胞之一。TAMs主要是由肿瘤微环境中分泌的趋化因子通过招募外周血中的单核细胞到组织中并在微环境中炎症因子的作用下进一步分化而来。巨噬细胞在不同的炎症因子的作用下可以分化成不同的亚型。Th1细胞因子可激活巨噬细胞并使其向M1型巨噬细胞分化。Th2细胞因子可将巨噬细胞分化成M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，发挥抵抗肿瘤进展的功能；M2型巨噬细胞主要分泌抑炎因子，促进肿瘤的进展。目前认为TAMs的功能更偏向于具有促癌作用的M2型巨噬细胞，因此M2型巨噬细胞通常被认为是TAMs的表型。CD163、CD206为巨噬细胞表面受体，是TAMs相对特异的标志物。TAMs的浸润与多种肿瘤，包括淋巴瘤、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌的恶性程度及不良预后密切相关，即TAMs浸润数目越多，提示患者处于越晚期的状态，预后越差。目前研究者们逐渐开始关注巨噬细胞在肿瘤转移中的作用。在远端转移模型中，TAMs在肿瘤远端肺、肝转移前微环境的形成中起着关键作用。然而，TAMs在局部癌旁肠道组织中的浸润情况以及功能尚不清楚。
本研究中，在第一部分，我们分别在基因水平、蛋白水平检测了TAMs在结直肠癌患者组织中的分布情况，明确TAMs在癌旁组织中浸润较多，并进一步分析其功能以及与临床参数、患者预后之间的关系，发现TAMs在癌旁组织中分泌抑炎因子较多，且其浸润数目越多，患者分期越晚，预后越差。其次，在第二部分中，我们进一步探究TAMs在癌旁组织中浸润的机制，首先通过筛选与单核细胞招募相关的趋化因子发现CXCL12在癌旁组织中分泌水平较高，同时发现CXCL12主要来源于成纤维细胞。通过阻断CXCL12、CXCR4，进一步明确了CXCL12/CXCR4信号通路在成纤维细胞促进TAMs累积过程中的作用。我们进一步探究了CXCL12促进单核细胞极化的机制，发现CXCL12主要通过与CXCR4结合后激活下游MAPK/ERK信号通路促进单核细胞分化。本部分阐明了癌旁组织中TAMs的浸润主要通过CXCL12/CXCR4/MAPK/ERK信号通路。然后，在第三部分中，我们构建了原位成瘤模型，明确了靶向CXCR4可以逆转TAMs在癌旁部位的累积及其对肿瘤侵袭的影响。最后，在第四部分中，我们通过临床样本检测CXCL12、CXCR4信号通路分子的表达与TAMs、肿瘤侵袭转移分子的相关性及其与临床参数的关系。本研究阐明了TAMs在结直肠癌旁组织的浸润情况及其浸润机制，揭示了结直肠癌患者术后肠道复发的原因，为结直肠癌患者的治疗提供新的靶点。
第一部分TAMs在结直肠癌患者组织中的表达及临床意义
研究方法
1)荧光定量PCR、流式细胞分析技术检测结直肠癌患者癌组织、癌旁组织及正常肠道组织中TAMs的表达水平及功能。
2)免疫组化方法检测结直肠癌患者组织中CD163的表达水平。
3)免疫荧光实验检测CD14与CD163的共定位情况。
4)磁珠分选及流式细胞仪分选结直肠癌组织及癌旁组织中的TAMs。
5)多因子检测分析结直肠癌组织及癌旁组织中TAMs的炎症因子的分泌水平。
6)利用TCGA及GEO数据库验证TAMs在结直肠癌组织及癌旁组织的表达水平。
研究结果
1)TAMs在结直肠癌旁组织中高表达。
2)结直肠癌旁组织中TAMs的浸润越多，患者分期越晚，预后越差。
3)结直肠癌旁组织TAMs分泌抑炎因子较多，发挥促肿瘤功能。
第二部分TAMs在结直肠癌旁组织中累积的机制
研究方法
1)荧光定量PCR方法检测结直肠癌组织及癌旁组织、正常肠道组织中趋化因子的表达及体外极化实验中M1、M2相关标志物的水平。
2)ELISA方法检测组织上清中CXCL12的分泌水平。
3)磁珠分选方法从健康人外周血单个核细胞中分离纯化出单核细胞。
4)Transwell方法检测CXCL12及成纤维细胞上清对单核细胞的趋化能力。
5)流式细胞分析技术检测趋化因子受体在结直肠癌患者外周血单核细胞上的表达情况及单核细胞向M2极化的比例。
6)免疫荧光共定位方法检测CXCL12的主要来源。
7)Westernblotting方法检测CXCL12对单核细胞极化相关信号通路的影响。
研究结果
1)CXCL12在结直肠癌旁组织中高表达并与TAMs呈正相关。
2)CXCL12主要来源于成纤维细胞。
3)结直肠癌旁组织中TAMs的累积主要通过CXCL12/CXCR4/MAPK/ERK信号通路促进单核细胞的招募与极化。
第三部分动物实验验证CXCL12/CXCR4通路在结直肠癌旁TAMs累积中的作用
研究方法
1)构建Balb/C裸鼠及野生型小鼠原位成瘤模型。
2)构建Luc-GFP-HCT116、Luc-GFP-CT26细胞系。
3)磁珠分选及流式细胞仪分选健康人外周血中的CXCR4+CD14+和CXCR4-CD14+两群细胞。
4)流式及荧光定量PCR方法检测TAMs在原位成瘤小鼠组织中的累积情况。
5)小动物活体成像系统观察小鼠原位肿瘤及肠道侵袭肿瘤的荧光强度。
6)免疫荧光实验检测TAMs及肿瘤细胞在组织中的浸润情况。
研究结果
1)CXCR4+CD14+单核细胞更易向结直肠癌旁组织累积并促进肿瘤向肠道部位的侵袭。
2)靶向CXCR4抑制TAMs在癌旁组织的累积并阻止肿瘤进展。
第四部分临床标本验证CXCL12、CXCR4的表达与TAMs的关系
研究方法
1)免疫组化方法检测结直肠癌患者组织中CXCL12、CXCR4在蛋白水平上的表达情况。
2)利用TCGA数据库验证CXCL12、CXCR4在癌旁组织的表达水平，并分析与TAMs相关标志物和肿瘤侵袭转移相关基因之间的相关性。
研究结果
1)CXCL12、CXCR4在结直肠癌旁组织的表达与TAMs密切相关。
2)CXCL12、CXCR4与患者不良预后相关的临床参数有关联。
3)CXCL12、CXCR4及TAMs与肿瘤侵袭转移相关标志物呈正相关。
结论
1)TAMs在结直肠癌旁组织中高表达且与患者不良预后相关。
2)TAMs在结直肠癌旁组织中高分泌抑炎促癌因子，发挥促肿瘤作用。
3)TAMs在结直肠癌旁组织中的累积主要通过成纤维细胞分泌CXCL12与单核细胞表面CXCR4结合激活下游MAPK/ERK信号通路促进单核细胞的招募与极化。
4)靶向CXCR4逆转TAMs在结直肠癌旁部位的聚集及对肿瘤侵袭的影响。
5)结直肠癌旁组织中CXCL12、CXCR4信号通路分子及TAMs的浸润与肿瘤的侵袭转移密切相关。