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研究背景和目的:
目前常规检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的方法主要包括核心抗原检测、抗体检测以及核酸检测。多年以来，很多研究试图建立血液中各种HCV抗原抗体以及核酸的检测方法，但由于人体血液中HCV抗原抗体及核酸含量过低，用这些常规方法有时会无法检测出HCV。
HCV核心抗原检测方法主要是用双抗体夹心法检测人体血清中的丙型肝炎核心抗原，该方法的基本步骤是:用基因工程制备核心抗原进行小鼠免疫后获得纯抗HCV核心抗原的单抗作为固相包被物，配合使用辣根过氧化物酶标记物的2抗，与血清中的HCV核心抗原反应，显色后进行定性或定量测定。该方法检测具有延后性，而且灵敏度不高。
另外一种检测HCV的方法是将HCV病毒经过逆转录成cDNA，再通过PCR将cDNA扩增进行检测。但是由于血液中的 RNA浓度低，有时并不能检测到HCV的 RNA，所以传统的方法不能满足丙肝病人的血清或者分泌物中极低浓度的RNA检测。
近年来，表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)已逐步成为研究和识别生物活性材料亲和力作用的主要方法之一。SPR传感器已逐步应用到分析抗原抗体反应、观察DNA的杂交、诊断细菌和病毒引起的疾病和观察血液凝固等。SPR传感器之所以能够将具有相似化学结构的混合物区分开，是因为SPR能够识别这些分析物，并且这些分析物能够和固定在SPR传感器表面上的生物活性物质发生特异性反应。SPR传感器还可以免标记、实时监测分析物和活性物质之间发生的反应。SPR传感器不仅可以监测固定在材料上的分析物，还可以分析经过解离新形成的混合物，在很多情况下，SPR可以用同一个芯片，进行同时测量。因此，目前SPR是观察配体和受体之间、抗原和抗体之间相互作用最有前景的一个方法，并且逐步应用到生物医学当中。SPR在不断扩展其应用领域时，其检测方法的灵敏度也需要不断得到提高。因为SPR方法对待测物浓度的测定主要与物质的分子量有关，对于分子量大于1000的物质，其可测定浓度范围约为nM-pM，而对于分子量小于1000的物质，其可测定浓度范围为μM-nM。因此不断探索提高灵敏度的研究方法正成为SPR研究中的一个重要内容。
DNA芯片被大量用于快速、平行检测多种DNA或RNA序列。随着越来越多的斑点技术的扩展，现在使用喷墨打印或光刻生产的DNA芯片，可以在一个小面积的固体支持物上点上15000种寡核苷酸链，因此目前很多研究已将DNA芯片应用到mRNA定性定量检测和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的检测。随着DNA芯片技术的发展使得单个DNA芯片探测整个基因组成为可能，但对低浓度的DNA靶序列检测存在灵敏度不高的问题依然是当前芯片的主要缺点。而液相预扩增方法可克服这一缺点，例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，可用来扩增芯片分析的目标DNA。PCR技术由于其高灵敏度而被认为是DNA检测的金标准。但是，PCR技术因为需要昂贵的仪器、精确的温度控制和对其产物进行凝胶电泳分离，况且不能原位扩增，使它在芯片上的运用受到极大地限制。因而迫切需要一种高灵敏度、高通量和高速度非PCR的简单的检测分析方法。
滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)在体外使用DNA聚合酶和环状DNA模板进行信号扩增，其基本原理是:环状模板与靶核酸杂交后在连接酶的作用下成环;成环后的环状模板在引物的作用下扩增;沿着环状模板扩增一个循环后，聚合酶合成再次到达了引物聚合酶结合位点取代新合成的DNA链;继续合成多个环状模板长度的扩增链，由此形成一条由重复的环状模板序列组成的长链DNA分子。并且由于环状模板的扩增效率比线性模板要高很多，因此单引物RCA已被广泛用于基因分型和挂锁探针进行突变分析。
RCA是一种对芯片信号放大特别有效的方法，在芯片上就能够识别、扩增、检测目标分子。与其它扩增方法相区别的是，RCA扩增生成的扩增产物仍然和固定在芯片上的DNA引物连接。由于这种独特的属性，使RCA能在固相的原位产生微阵列信号，并且与其它反应同时进行也没有任何互相干扰。
基于纳米金的光学检测可以提供一个可视化的可见光范围。由于这种光学检测是依靠基础的光学现象，所以检测过程比荧光技术要简单得多，样品的稳定性也被加强了。相比于荧光染料具有敏感性和漂白问题，纳米金技术即使是在高光强度下也可进行检测，并且还能降低理化环境对信号的影响。
纳米金技术可以扩增SPR的检测信号，相比非纳米金辅助的杂交反应大大提高了灵敏度。表面质量高和介电常数高的纳米金粒子和金膜之间的电磁耦合大大提高了反射转变。纳米金粒子标签具有高信号/噪声比使得点大小接近亚微米级，而荧光芯片仅有微米级。纳米金法可以利用光学方法读出结果而不需要荧光设备，并且纳米金修饰的寡核苷酸探针可以再生方法再利用，以节约成本。
本文将生物传感技术、原位扩增技术以及纳米技术相结合，运用SPR仪检测纳米金辅助的RCA反应，实现快速、非标记、灵敏、实时检测丙型肝炎病毒。
研究方法:
1.丙型肝炎病毒RCA检测方法的建立
1.1.RCA引物设计
从GeneBank中获得丙型肝炎病毒X-tail基因序列，根据RCA引物设计的原则，设计RCA检测HCV所需要的环状模板、延伸引物以及扩增引物。
1.2.丙型肝炎病毒核酸RCA检测方法反应条件摸索以及反应体系的建立
根据反应体系进行优化，将连接酶分为T4 DNA连接酶、pfuDNA连接酶和BSTDNA连接酶三组。将多聚酶分为BSTDNA多聚酶和phi29DNA连接酶两组，共六组进行试验。依据Tm值，RCA反应原理以及酶的活性温度，来测试反应温度。
1.3.丙型肝炎病毒核酸RCA检测方法特异性测试
选取流感病毒核酸作为阴性对照，选取实验室制备的丙型肝炎病毒核酸纯化标准品作为阳性对照，双蒸水作为空白对照，以RCA方法评价丙型肝炎病毒的特异性。
1.4.丙型肝炎病毒RCA检测方法最低检测浓度测试
将经过定量的HCV cDNA阳性标准品，进行10倍梯度稀释，运用RCA方法确定其检测限值。
2.Real-time RT-PCR法检测丙型肝炎病毒
选取HCV最保守区域X-tail基因区域为目的序列，设计Real-time PCR引物。运用Real-time PCR法检测HCV，通过检测梯度浓度确定其检测限，与RCA的检测限进行比较。
3.滚环扩增芯片检测HCV cDNA
将RCA的探针进行氨基修饰，与醛基芯片共价结合后，通入检测体系进行滚环扩增反应，最后进行显色反应，以检测HCV DNA。
4.传统芯片检测HCV cDNA
将经过定量的HCV cDNA阳性标准品，进行10倍梯度稀释，用传统芯片检测，并将其检测限值与RCA芯片法进行比较。
5.SPR技术结合RCA法检测HCV
根据丙型肝炎X-tail区域的特异序列，设计并合成RCA法的探针和引物，同时设立阴性对照。将模板浓度10倍梯度稀释，评价方法的检测限。在普通金膜芯片的基础上，经过表面化学处理，形成高特异性核酸芯片，用抗蛋白实验验证芯片抗蛋白能力。使用SPR仪对金膜芯片上滚环扩增的反应进行动态观测以及信号放大反应等。
6.普通SPR技术对HCV的检测
(1)普通SPR金膜芯片制备:将裸金膜芯片孵育于12巯基十二烷酸中过夜进行自组装羧基化，再用EDC/NHC(1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC); N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuceini- mide，NHS))进行活化后点样探针。
(2)用1％的BSA对未结合位点进行封闭。
(3)评价SPR检测HCV的灵敏度、特异性。
7.运用RCA、，real-time PCR、genochip、，RCA genochip、SPR、SPR结合RCA等技术对临床样品HCV的检测。
采用1～6方法中描述的丙型肝炎病毒RCA、Real-Time RT-PCR、滚环扩增芯片法、传统芯片方法、SPR技术结合RCA法、普通SPR法检测临床血清标本中的丙型肝炎病毒。对上述检测方法的灵敏度，特异性以及一些其它指标进行评价。
结果:
1.丙型肝炎病毒RCA方法的实验室评价以及评价临床样品的检测
RCA方法对HCV的最低检测浓度为10pM，Real-time RT-PCR检测的的最低浓度为0.1nM。
对63份标本进行检测，其中丙型肝炎病人血清标本30份，非丙型肝炎血清标本33份。在双盲的情况下，RCA法的灵敏度为80.0％(24/30)，检测30份丙型肝炎血清标本，实时荧光定量PCR检出16份。RCA检测33份HCV阴性血清特异度为87.9％(29/33)，实时荧光定量PCR为90.9％(30/33)。
2.建立滚环扩增芯片检测HCV的方法以及对临床样品检测的评价
RCA芯片法检测HCV的最低检测浓度为0.1μM。而应用传统杂交方法检测HCV cDNA阳性标准品的最低浓度为10μM。说明在实验室条件下检测HCVeDNA，RCA比传统杂交法更敏感。
用RCA芯片对一共179份临床血清进行了检测，其中包括丙型肝炎病人血清样品102份，甲肝及乙肝病人的血清样品77份。在双盲的情况下，RCA的敏感性为87.3％(89/102)，特异性为85.7％(66/77)，一致性为86.6％(155/179)，结果显示RCA芯片法检测HCV的灵敏度和特异度均较好。阳性预测值为89％(89/100)，阴性预测值为83.5％(66/79)。检测102份丙型肝炎血清标本，RCA芯片检测出89份，普通芯片只检出27份。检测77份阴性样品，RCA检测为阴性的66份，普通芯片为69份。RCA芯片高灵敏度、快速，因此在丙型肝炎病毒的检测中比现有的普通芯片有更大的优越性和实用性。
3.SPR技术结合滚环扩增技术检测临床样品中HCV
滚环扩增法在1h内完成HCV标准品的检测，SPR结合RCA方法对HCV的阳性标准品的最低检测浓度为1pmol/L，Real-time PCR的最低检测浓度为100pmol/L。在检测相同的HCV浓度时，RCA的SPR信号明显高于传统的杂交信号，RCA反应经过纳米金信号放大，整个反应过程更加清晰，反应信号也得到扩大。对于临床样品的检测，RCA结合SPR技术的灵敏度为90％(27/30)，特异性为84.1％(28/33)。
结论:
1.本研究建立的SPR结合RCA方法，在1h内完成HCV的检测，比荧光定量PCR有更低的检测限。
2.运用RCA法检测同样浓度的HCV时，RCA的SPR信号明显高于传统的杂交的SPR信号RCA，经过纳米金的信号放大，整个反应过程流程更加清晰，反应信号得到进一步扩大。
3.对于临床血清样品，研究结果显示RCA法的灵敏度比real-timePCR要高，特异度没有统计学差别。
4.由于SPR结合RCA检测HCV快速、不需要特殊设备，因此在丙型肝炎病毒的检测中比现有的real-time PCR方法有更大的优越性和实用性。
5.本文实现了SPR检测纳米金辅助的RCA反应，将来可能对超灵敏的核酸进行检测，这将为一些极低浓度核酸样品的检测提供可能。SPR技术结合滚环扩增法将生物传感技术及原位扩增技术相结合，实现了快速、非标记、实时检测丙型肝炎病毒，可作为丙型肝炎病毒筛查方法。