论文部分内容阅读
噻唑是一类应用广泛的五元芳香杂环，独特的结构决定了它很容易与靶标蛋白形成氢键、π-π堆积、静电和疏水等多种非共价键相互作用。噻唑类化合物的生物活性几乎涵盖了整个医药领域，许多噻唑类衍生物具有活性高、毒性低、不良反应少、多药耐药性少、生物利用度高、给药方式多样化等优势，其应用日益受到关注。其中，2-氨基噻唑是应用最广泛的噻唑类衍生物之一，2-位氨基的存在不仅方便噻唑同其它活性片段拼接，而且可改善化合物水溶性，增加氢键相互作用。 为了进一步挖掘2-氨基噻唑类衍生物的成药潜力，丰富该类化合物结构和活性的多样性，本论文主要从以下两个方面进行这类化合物的设计和合成:1）以处于临床研究阶段的葡萄糖激酶(GK)激动剂PSN-GK1为先导化合物，根据代谢的机理，在噻唑的5-位引入水溶性取代基-氨基酸片段或者三氮唑结构，占据噻唑5-位代谢位点，增加稳定性;在噻唑的4-、5-环合成含氮原子的脂肪环，同时阻断4-、5-位，从而避免产生代谢毒性，期望维持高的GK激动活性并且改善前期化合物4-1水溶性差的缺点;2）基于受体结构进行ALK小分子抑制剂的设计，将2-氨基噻唑引入到2，4-二氨基嘧啶母核中，作为苯环的生物电子等排体，占据处于铰链区和溶剂作用区之间的脂溶性口袋，从而获得结构新颖、活性高的抗肿瘤ALK抑制剂。 糖尿病是全球范围内发病率增长最快的疾病之一，现有的治疗手段不仅容易产生多种副作用，而且往往不能达到预期的治疗效果。GK是抗糖尿病的新靶点，由于其在人体内环境中对血糖的平衡起到的双向调节作用而备受关注。迄今虽有多种GK小分子激动剂进入过临床研究阶段，但仍然没有药物上市。作为课题组前期工作的延续，我们以化合物PSN-GK1为先导化合物，基于代谢的机制，设计并合成了一系列结构新颖具有GK激动活性的2-氨基噻唑类衍生物。其中，含有羟乙基三氮唑取代的2-氨基噻唑类化合物4-21和2-氨基噻唑并环戊酮的衍生物4-30a具有较好的GK激动活性，IC50值分别为0.18和0.317μM，最大激活倍数分别为1.37和2.64倍。另外，它们的水溶性同前期化合物4-1相比大大改善，预测值分别为34.35和13.32μg/mL。随着PSN-GK1等一系列GK激动剂临床试验的失败以及对GK靶点的质疑声越来越多，我们没有继续化合物4-21和4-30a的体内降血糖实验，转而将2-氨基噻唑类衍生物用于抗肿瘤药物的研发。 酪氨酸激酶ALK与棘皮动物微管蛋白样-4形成的融合蛋白(EML4-ALK)是近年来新发现的癌变驱动基因，其靶向性抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的前沿热点。目前已有十几个ALK抑制剂处于临床研究的各个阶段，其中Pfizer公司研发的Crizotinib已于2011年上市，然而上市不久即出现了耐药性。因此，新型的能克服Crizotinib耐药性的ALK抑制剂的研发迫在眉睫。分析已知的小分子抑制剂和ALK的共晶结构可知（以TAE684为例）:嘧啶的1-位N和2-NH同铰链区Met1199形成氢键作用，两个侧链分别伸向脂溶性口袋和溶剂作用区。我们注意到在铰链区和溶剂区之间也存在一个半开口的‘U型’脂溶性口袋，二氨基嘧啶类ALK抑制剂在该位置均采用苯环占据该口袋，未有杂环的报道。我们首次将2-氨基噻唑引入到嘧啶母核中，作为苯胺的生物电子等排体，期望2-氨基噻唑同样能占据该脂溶性口袋，促进小分子同ALK的结合。我们设计并合成了一系列4-位酯基、酰胺单取代的，以及2-氨基噻唑并哌啶、高哌啶等并环形式双取代的2-氨基噻唑类衍生物。其中，化合物6-25g和6-25h对ALK酶的抑制活性最高，IC50值分别为18.0nM和12.4nM，但细胞抑制活性并不高，接近1μM。通过对代表性化合物6-30进行酶谱筛选、6-25a进行hERG抑制活性的测试以及6-25h同ALK的对接试验，发现该系列化合物选择性较好，安全性高，同ALK的结合切实有效，值得进一步优化。 为提高2-氨基噻唑并高哌啶类衍生物的透膜性及细胞活性，我们设计了两类2-氨基噻唑并高哌啶生物电子等排体，2-氨基噻吩类以及3-苯氮卓类衍生物。3-苯氮卓类化合物相比工具药TAE684，以并环的形式进行了构象限制，同时我们在苯氮卓的1-位引入取代基，期望该类化合物能同ALK形成独特的药效构象，从而克服Crizotinib的耐药性问题。其中，1-位甲基取代的3-苯氮卓类衍生物7-36a具有很好的体外ALK/c-Met抑制活性，IC50值分别为5.7nM和9nM。对ALK和c-Met依赖性的细胞抑制IC50值分别为7nM和14nM，相比2-氨基噻唑并高哌啶类化合物大大改善。化合物7-36a在不影响蛋白表达的情况下，能够以剂量依赖的方式显著抑制ALK和c-Met不同细胞株中ALK和c-Met磷酸化及由其活化引起的下游信号分子的磷酸化。PK性质良好，生物利用度为20.6％。体内实验在裸小鼠BaF3-EML4-ALK移植瘤模型上，1mg/kg剂量下的抑瘤率为60.6％，但当剂量继续增加到10mg/kg时，该化合物表现出明显的毒性作用，裸小鼠出现大量死亡。测试hERG抑制活性发现，化合物7-36a对hERG钾离子通道的抑制IC50值达720nM。 为了降低3-苯氮卓类化合物7-36a的hERG毒性，我们将七元环打开，减少N上取代基，引入一系列裸露的氨基酸得到新一代的ALK抑制剂。其中，甘氨酸取代的化合物8-8a不仅保持了很好的ALK抑制活性（IC50值为32.8nM），hERG毒性也大大降低到15μM。为得到ALK选择性的抑制剂，我们在嘧啶的4-位引入邻位异丙基砜基取代的苯胺，得到化合物8-13，其对ALK酶的抑制IC50值达到2.7nM，对c-Met的选择性达到57倍。该化合物对多种ALK依赖性的肿瘤细胞都有很好的抑制作用，其中对SUP-M2细胞的抑制IC50为15nM，而ALK非依赖性的细胞株A549抑制IC50为1.1μM。更重要的是该化合物对多种ALK二次突变的肿瘤细胞株都有抑制作用，显示出其具有克服Crizotinib耐药性的潜力。NPM-ALK融合基因介导的SUP-M2裸小鼠模型上，化合物8-13在50mg/kg剂量下对肿瘤的生长抑制率达到89％，进一步的研究正在进行中。