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为构建毛冠鹿睾丸组织cDNA文库,用TRIzol试剂提取总RNA,利用SMART(switchingmechanism at 5end of RNA transcript)技术合成cDNA第一链,双链cDNA经LD-PCRfLong-distance PCR)扩增并经sfi I酶切和过柱分级分离后,克隆入经sfi I酶切的λTriplEX2载体,经体外包装而成cDNA原始文库。该毛冠鹿睾丸组织cDNA原始文库含有独立克隆数度为1.01 kb。通过随机挑取噬菌斑,并克隆测序,从该文库中克隆了毛冠鹿睾丸组织表达基因:Pl精蛋白基因(PRMl)(GellBank序列号:DQ299383),该cDNA具有5’和3’非编码区,从第95至250个核苷酸为一完整阅读框(ORF),此阅读框编码一个51 Aa的P1精蛋白。结果显示本文构建的毛冠鹿睾丸组织cDNA文库符合建库要求,可作为进一步克隆毛冠鹿睾丸组织特异表达基因的可靠材料。
提取毛冠鹿基因组DNA,用EcoR I、EcoR V和Pst I酶切毛冠鹿基因组DNA。将酶切后的基因DNA转移至尼龙膜。用PCR法标记PRMl 基因地高辛(DIG)探针,进行Southern杂交。结果显示,经EcoR I酶切的基因组DNA和探针杂交后雌雄结果无差异。3种限制性内切酶消化并杂交后,都产生了2条带,而且限制酶切图谱表明该基因内部(包括内含子)无此3种内切酶位点。以上结果表明PRMl 基因在毛冠鹿基因组DNA中存在两种形式的拷贝。
以毛冠鹿脑、肌肉、心脏、肺、睾丸、肾、肝和脾的总RNA为模板,合成cDNA第一链。用毛冠鹿P1精蛋白基因特异引物RT-PCR分析了不同组织PRMl表达状况。为保证模板用量的一致,以毛冠鹿β<,2>-微球蛋白基因的RT-PCR扩增产物作为阳性对照。结果表明PRMl基因仅在睾丸组织中表达,而其他组织不表达。
由于PRMl基因具有高度进化速率,使得它们成为一个很有效的系统进化分子标记。根据毛冠鹿PRMl cDNA序列设计引物。从毛冠鹿、小麂、赤麂、黑麂和獐的基因组DNA中克隆PRMl基因。结果显示,5种动物的PRMl基因都只含有1个内含子,内含子序列长度都是101个碱基。用从GenBank中检索的牛PRMl基因为外群,用Clustalxl.8、Mega3.0及DNAstar软件构建系统进化树,结果表明,赤麂先和黑麂会合,其次与小麂会合,再与毛冠鹿和獐会合,最后与牛会合。该结果支持麂亚科动物进化遵循染色体从多到少的原则。